食管鱗癌組織中抑癌基因Crnn的表達及其臨床意義

別亞男，喬俊靜，王 瑾，張 昭，秦艷茹

(鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 河南鄭州 450052)

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，而且位列惡性腫瘤致死率的第6位［1］。食管癌主要有兩種類型，這兩種有不同的病原學及病理學特征，ESCC是食管癌的主要組織學亞型，在不同國家及國家內不同地區有著明顯的地域分布。雖然經過多科治療，但是它的預后仍然比較差，而且5年生存率低于15%［2］。它的發生、發展是與遺傳因素、環境因素等多因素、多步驟相關的過程，在這個過程中可能涉及到多個癌基因的激活和抑癌基因的失活。迄今為止，導致ESCC的分子和細胞機制仍未完全明確。

Crnn蛋白是S100蛋白中的一員，在N端有一鈣結合位點［3］。另一項研究表明，Crnn基因是融合基因中的一員，可能在表皮分化中起到重要的作用［4］。雖然Crnn基因在ESCC中表達下調，很可能在正常組織向腫瘤組織轉變中丟失［5］，但Crnn蛋白表達情況及其與臨床病理特征和5年生存率之間的關系卻沒有相關研究。為此我們采用免疫組化方法檢測了Crnn蛋白在食管癌患者組織中的表達水平，進一步了解ESCC的發生、發展及影響預后的機制。

1 材料與方法

1.1 研究材料 100例食管癌組織及相應的癌旁正常黏膜組織(距離腫塊組織5 cm以上)均來自河南省林州市人民醫院(2002年1月至2005年1月)，其中男46例，女33例;年齡＜59歲43例，≥59歲36例;高分化12例，中分化50例，低分化17例;TNM分期(2002年AJCC分期)Ⅰ期11例，Ⅱ期52例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例;淋巴結轉移21例?；颊咝g前均未接受任何放療或化療，所有標本經組織病理學檢查證實為原發性食管鱗狀細胞癌。

1.2 組織芯片制作 收集常規病理切片和HE染色，然后在病理切片上根據形態學特點確定好具有代表性的腫瘤部位，用組織陣列儀支架上的X、Y軸刻度尺定位后，用穿刺取樣針在供體蠟塊相應的位置進行穿刺取樣。預先制備1個45×20×20 mm3大小的受體蠟塊，用組織陣列儀(廣州浩翰儀器有限公司生產)穿刺取樣針打出間距為1.8 mm，直徑為1 mm，深度為3～4 mm的孔。然后，將用組織陣列儀穿刺所得的微小圓柱形組織擠壓到受體蠟塊上已制備好的陣列孔中。

1.3 免疫組織化學法 將使用標準的生物素-親和素-過氧化物酶復合物方法對免疫組化染色進行操作。簡單來說，石蠟切片脫蠟，加入10%的山羊血清10 min，非特異性結合被阻斷。然后加入抗Crnn多克隆抗體孵育(1∶100稀釋，4℃過夜;英國劍橋Abcam公司)。之后在辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔免疫球蛋白中孵育(1∶100稀釋，37℃ 30 min)。細胞質中Crnn的表達分為3個獨立的等級，因為沒有發現有明顯的細胞著色百分比的差別，因此免疫反應性只用染色強度表示(0=未被染色;1=弱染色;2=強染色)。共有79例正常組織及食管鱗癌組織均有效表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件，數據分析應用χ2檢驗、Fisher精確概率法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Crnn蛋白表達情況 ESCC組織中Crnn蛋白表達陽性率為45.6%(36/79)，食管正常黏膜組織中Crnn蛋白表達陽性率為93.7%(74/79)，兩組間表達比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1和圖1。

表1 兩組Crnn蛋白表達情況(n，%)

圖1 Crnn蛋白表達情況評分標準(SP染色×400)

2.2 Crnn表達與ESCC臨床病理特征的關系 Crnn基因在ESCC中的表達下調與不同的年齡組、性別組、腫瘤細胞分化程度和大體分型可能無關(P＞0.05)。Crnn與TMN分期相關(P=0.035)，隨著分期增加，Crnn表達下調率逐漸增加，0期～ⅡA期(45.8%)，ⅡB期～ⅣB期(75%);Crnn基因的表達下調與淋巴結轉移相關，有淋巴結轉移表達下調率76.2%，無淋巴結轉移表達下調率44.8%，兩組間差異具有統計學意義(P=0.021)，見表2。

表2 Crnn表達缺失與ESCC患者臨床病理特征的關系［n，(%)］

2.3 Crnn表達與ESCC患者的5年生存率的關系 Crnn基因表達下調ESCC患者的5年生存率明顯低于Crnn基因正常表達的ESCC患者(P=0.021)，見圖2。

圖2 Crnn表達與ESCC患者的5年生存率的關系

3 討論

Crnn基因位于染色體1q21，該基因包含3個外顯子，編碼一個含有495個氨基酸的蛋白質，N端包含一個鈣結合位點，屬于S100家族蛋白［6］。S100家族蛋白的功能相當復雜，而且它們在腫瘤的發生發展中扮演重要的角色［7］。一項研究表明，Crnn蛋白能夠通過上調兩種蛋白質的表達來抑制細胞周期中G1/S轉變［8-9］，從而抑制細胞生長、促進細胞凋亡和衰老，該蛋白的表達下調或缺失可能導致腫瘤的發生。

通過此次研究發現，食管正常黏膜組織中Crnn蛋白表達陽性率為93.7%，而食管鱗癌組織中存在高頻率的表達下調(表達下調率為53.2%);食管鱗癌中Crnn基因表達率與淋巴結轉移和TNM臨床分期有關(P均＜0.05)，與正常組織相比，Crnn基因表達改變可能與淋巴結轉移與否有關，這一結果說明Crnn基因表達下調導致出現淋巴結轉移的現象進而影響預后;ⅡB期及更晚分期的ESCC患者腫瘤細胞的表達下調率高于早期，說明ESCC晚期病例Crnn基因表達下調更為顯著，該基因可能參與了食管鱗癌的發展過程，并且隨著腫瘤的進展，Crnn的表達下調增加。目前關于Crnn基因表達下調可導致ESCC的發生、發展的機制還不是十分清楚，有研究表明可能通過以下機制發揮作用:Crnn基因通過上調P21WAF1/CIP1和Rb這兩種蛋白質的表達來抑制細胞周期中G1期向S期轉變。G1/S期轉變是細胞周期循環進展的一個重要關卡，而P21WAF1/CIP1是這一轉變期間具有決定性的負性調控因子之一。Rb是另一腫瘤形成過程中重要的抑制基因，當rb基因突變或丟失時，E2f轉錄因子會被釋放然后導致促進細胞生長的基因的過度表達［10-11］。因此當Crnn基因表達下調或缺失時，會使抑制細胞增殖的兩種蛋白質表達下降，從而導致細胞過度分裂。通過上面的機制表明，Crnn基因對細胞增殖起負性調節作用。

本研究發現Crnn基因表達下調的ESCC患者的5年生存率明顯低于Crnn基因正常表達的食管鱗癌患者，說明Crnn表達下調的腫瘤比Crnn正常表達的腫瘤更具有侵襲性和轉移性，Crnn蛋白表達下調對惡性腫瘤細胞侵襲作用的抑制性減弱，使腫瘤侵蝕及轉移進而影響患者的生存時間，Crnn可能作為影響患者生存時間的一個獨立因素;Crnn基因在ESCC中的表達下調與不同的年齡階段、性別、腫瘤細胞分化高低和大體分型可能無關(P均＞0.05)。

近段時間研究表明，在很多實體腫瘤中都能檢測到在lq21染色體位點上雜合性的丟失(LOH)，包括食管鱗狀細胞癌［12］、肺癌［13］、胰島素瘤［14］和食管上皮腺癌［15］。更有意思的是，lq21位點雜合性的丟失和腫瘤的惡性度［14］及生存時間縮短有關［15］。由此我們可以推測，Crnn基因位點處雜合性的丟失導致了ESCC的發生、發展。

綜上所述，Crnn基因的表達下調參與了食管鱗狀細胞癌的發生、發展與預后，Crnn基因表達的下調可能與食管鱗癌的淋巴結轉移、臨床分期及生存時間有關，Crnn基因表達下調與否的檢測對食管鱗癌的臨床診斷可能具有一定的價值，同時可以為判斷患者預后提供參考。

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