豬支原體肺炎常用實驗室診斷方法概述

于新友，李天芝，王金良，李書光，苗立中，沈志強,

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

本文對豬支原體肺炎的臨床癥狀、病理學變化、酶聯(lián)免疫吸附試驗及PCR診斷方法的最新研究進展及各種診斷方法的優(yōu)缺點進行全面概述，以期為實驗室尤其是基層獸醫(yī)工作者對豬支原體肺炎的早期診斷和及時防治提供一定的指導，為預防和控制豬支原體肺炎奠定基礎。

豬支原體肺炎又稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一種慢性呼吸道傳染病，臨床上以咳嗽、氣喘和肺部典型的“蝦肉”樣變?yōu)樘卣鳎哂薪佑|傳染性高、死亡率低和誘發(fā)性強的特點。Mhp是重要的豬支原體病原之一，可導致豬地方性肺炎。不同年齡、性別、品種的豬群均可感染，以咳嗽和氣喘為主要癥狀。雖然本病死亡率不高，但嚴重影響豬群的生長，導致料肉比增大、飼料報酬率降低。據(jù)不同國家的屠宰檢驗統(tǒng)計表明，豬支原體肺炎的典型病變率達30%～80%。因此，對豬支原體肺炎正確診斷非常重要。

1 臨床癥狀

豬支原體肺炎有明顯的喘氣癥狀，咳嗽，腹式呼吸，體溫及食欲變化不大而生長發(fā)育遲緩，多在天氣變化、飼養(yǎng)管理方式改變等應激因素的作用下誘發(fā)本病。根據(jù)病的經過，大致可分為急性、慢性和隱性三種類型，而以慢性和隱性最多，但所有這些類型可隨條件的變動而互相轉變，不能截然區(qū)分。急性型：常見于新發(fā)本病的豬群，尤以懷孕母豬、仔豬多見。病豬體溫正常（伴有繼發(fā)感染時可升至40℃以上），精神不振，呈腹式呼吸。慢性型：常見于老疫區(qū)的架子豬、育肥豬和后備母豬。早、晚吃食后或運動時發(fā)生咳嗽，咳嗽時，站立不動，背拱起，頸伸直，頭下垂，直至咳出分泌物為止。隨著病程的發(fā)展，常出現(xiàn)不同程度的呼吸困難。體溫一般正常，發(fā)育遲緩。隱性型：偶見咳嗽和氣喘，生長發(fā)育幾乎正常。一般情況下死亡率不高，但繼發(fā)性感染也造成嚴重死亡。診斷本病應以一個豬場整個豬群為單位，當豬群中發(fā)現(xiàn)一頭病豬，就可以認為是病豬群。

2 病理變化

剖檢發(fā)病嚴重及病死豬可見病變主要在肺臟、肺門淋巴結和縱隔淋巴結。當病處在炎癥發(fā)展期，肺臟膨大，有不同程度的氣腫和水腫。雙肺的心葉、尖葉、中間葉和部分病例的膈葉前下緣出現(xiàn)對稱性、融合性支氣管肺炎病變，其中以心葉最明顯，尖葉和中間葉次之。病變部位呈淡灰紅色或灰紅色、半透明狀、界限明顯、指壓無彈性、似鮮嫩的肌肉狀，俗稱“肉變”。隨著病程的延長和病情的加重，病變部位的顏色也逐漸加深，呈淡紫色、深紫色或灰白色、灰黃色，堅韌度增加，外觀像胰臟樣，俗稱“胰變”或“蝦肉樣變”。切面濕潤致密，支氣管流出渾濁、灰白色帶泡沫的漿液性或黏液性液體。肺小葉間結締組織增生、硬化。肺門淋巴結和縱隔淋巴結顯著腫大數(shù)十倍，呈灰白色，水腫，切面邊緣外翻，有時出現(xiàn)輕度充血。肝臟、脾臟、腸管表面覆蓋纖維素性滲出物；肝臟腫大、變硬，膽囊萎縮無膽汁；腎臟表面凹陷、有出血點；關節(jié)腔充滿黃綠色纖維素性、化膿性液體；肺淋巴結和腹股溝淋巴結腫大，切面有滲出物；腦膜水腫、出血。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗既可以檢測抗原，也可以檢測抗體，具有快速、簡便、特異性強、敏感性高的優(yōu)點，可用于大批量樣品的檢測。ELISA是目前國內外最常用于診斷Mhp的方法之一，具有能進行定量分析、敏感性高、特異性強的特點。劉茂軍等選用MhpJ株培養(yǎng)物制備抗原，建立檢測Mhp抗體的間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)方法。對136份樣品檢測結果表明，建立的Mhp間接ELISA抗體檢測方法與美國IDEXX公司生產的Mhp抗體檢測試劑盒檢測的符合率達到83.8%，假陰性率8.8%，假陽性1.5%。逯曉敏等建立了穩(wěn)定而特異的抗MhpIgA的間接ELISA檢測方法。批間與批內試驗結果證明該方法具有很好的穩(wěn)定性。初步應用表明，該方法可用于Mhp感染或免疫狀態(tài)的臨床監(jiān)測。祝永琴等將已構建的含有MhpP36基因的酵母表達質粒pPICZA-A-P36在酵母菌X-33里進行表達，并對表達的蛋白進行Western-blotting鑒定。建立了穩(wěn)定的抗Mhp IgG的間接ELISA檢測方法。應用該方法檢測豬鼻支原體、豬絮狀支原體、豬圓環(huán)病毒陽性血清等都是陰性，說明該方法具有良好的特異性。批內重復性試驗和批間重復性試驗的變異系數(shù)均小于8%，說明該方法具有良好的重復性。張長瑩等以原核表達純化的豬支原體MSG1重組蛋白為包被抗原，建立了檢測豬支原體的間接ELISA診斷方法。該檢測方法敏感性高、特異性強和可重復性好。該研究表明建立的間接ELISA方法為豬支原體的檢測和區(qū)域流行病學調查提供了一種快速簡便的血清學診斷方法。劉茂軍等利用MhpNJ株的DnaK基因通過SOE-PCR擴增和突變，獲得了目的片段并插入表達載體pET-28a(+)中，然后轉入宿主菌BL21(DE3)。重組質粒經1毫摩爾/升IPTG在37℃溫度下誘導5小時，目的蛋白可達到總蛋白的14.1%。WesternBlotting證明表達的重組蛋白具有Mhp反應原性，用該重組蛋白建立的ELISA方法可檢測到Mhp抗體。

4 PCR方法

PCR技術具有靈敏、特異、快速、簡便等優(yōu)點，是實驗室常用的分子生物學診斷技術，也是目前豬支原體肺炎準確、簡單、快速診斷的主要方法。

4.1 常規(guī)PCR

利用聚合酶鏈反應(PCR)可以快速地對培養(yǎng)物、肺臟、鼻拭子、支氣管洗液進行檢查，取得了令人滿意的結果。于敏等根據(jù)國內外發(fā)表Mhp 16srRNA基因設計了一對特異性引物，擴增出一個大小為653bp的特異性片段，敏感性試驗顯示這對引物能夠檢測到1ng的DNA，結果表明此方法特異且敏感。劉茂軍等根據(jù)Mhp的P36基因序列設計一對引物，建立了Mhp特異且敏感的PCR檢測方法，可區(qū)別豬鼻支原體、絮狀支原體和雞毒支原體，最低檢出量為4.26ng。張紅云等根據(jù)GenBank中MhpJ株P36蛋白基因的核苷酸序列設計1對引物，建立了快速檢測Mhp的PCR方法。采用所建立的PCR方法對42份疑似豬支原體肺炎（MPS）病料進行臨床診斷，發(fā)現(xiàn)有13份呈陽性（31.0%）。該PCR方法適合于MPS的臨床診斷，可為其防控提供可靠依據(jù)。王貴平用PCR方法對從湖南省長沙市收集的326份病料分別進行了Mhp和豬鼻支原體檢測，并對部分基因進行了序列分析。結果發(fā)現(xiàn)，Mhp檢出率為24.4%。朱鳳瓊等通過設計1對針對16srRNA的引物，建立了該病原的PCR檢測方法，該方法能從標準株和分離株中獲得陽性擴增，但不會與其他種類支原體或者是豬呼吸道中的常見微生物發(fā)生交叉反應。為證實擴增產物的特異性，對2個PCR產物進行純化、測序和序列分析，證實為肺炎支原體。

4.2 套式PCR

套式PCR又稱巢式PCR，即在第一對引物（外套引物）的擴增區(qū)域內另行設計一對引物（內套引物），用外套的擴增產物做模板進行第二次擴增。套式PCR外套擴增增加了起始模板量，內套引物擴增將目的基因進一步倍增至可觀察的量，由于采用兩對不同的引物二級放大，故可提高PCR檢測的靈敏度，保證產物的特異性，使靈敏度和特異性高于傳統(tǒng)的PCR方法。逯曉敏等根據(jù)GenBank中登錄的MhpP36(L-乳酸脫氫酶)全基因序列，設計合成了2對引物，建立套式PCR方法。運用該方法對Mhp不同菌株培養(yǎng)物進行了擴增，并對經肺內免疫豬支原體肺炎活疫苗后支氣管肺泡灌洗液進行了檢測。結果表明，不同菌種均能擴增出427bp的目的條帶，而其他病原菌未出現(xiàn)特異性擴增條帶。建立的套式PCR方法檢測Mhp的最低檢測限度為10個CCU(顏色變化單位)。吉瑪?shù)冉⒘藱z測Mhp的巢式PCR方法。結果表明，該方法對雞毒支原體、豬鼻支原體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬偽狂犬病毒的擴增結果均為陰性；第1次擴增的敏感性是10皮克，第2次擴增的敏感性是0.1皮克。

4.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是將PCR技術和光譜技術有效結合的一種核酸定量技術，克服了普通PCR反應時間較長、擴增產物需用瓊脂糖凝膠電泳檢測、易出現(xiàn)假陽性等缺點，具有靈敏度高、特異性強、定量準確、全封閉反應等優(yōu)點。宋建領等根據(jù)GenBank登錄的Mhp黏附素P97基因序列，設計1對特異性引物和1條探針，優(yōu)化了Mhp實時熒光定量PCR檢測方法。結果顯示，該方法能特異地檢測Mhp，與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒，豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒等病原檢測無交叉反應；針對Mhp陽性質粒標準品檢測，靈敏度可以達到10拷貝；重復性檢測Ct值變異系數(shù)在0.78%～1.16%之間。用建立的實時熒光定量PCR檢測方法，對40份臨床樣品檢測，結果表明肺臟拭子與肺臟懸液陽性率完全一致，而鼻腔拭子檢出率較低。同戈等建立了以P110基因序列作為靶序列的MhpSYBRGreen熒光定量PCR檢測方法，該方法具有良好的特異性、重復性，能夠檢測到10復制/微升的標準質粒，可用于Mhp培養(yǎng)疫苗半成品的快速定量檢測。丁敏等根據(jù)Mhp保守區(qū)域P110基因序列，設計一對特異引物和TaqMan探針，同時構建了P110基因標準質粒，并對TaqMan熒光定量PCR反應條件進行了優(yōu)化，建立了可以對Mhp培養(yǎng)物定量的熒光定量PCR檢測方法。研究結果表明，該方法檢測靈敏度可達13復制/微升。

5 環(huán)介導等溫擴增方法

環(huán)介導等溫擴增方法是日本學者Notomi等在2000年發(fā)明的一項恒溫核酸擴增新技術，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經濟等特點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應用。郭盼盼等建立了MhpLAMP的快速檢測方法，該方法以Mhp保守性基因16SrRNA為靶序列設計了6條特異引物，在63℃等溫條件下，30分鐘即可完成反應。結果顯示，LAMP技術優(yōu)于PCR技術。在敏感性試驗中，LAMP方法的能檢測出10個包含靶基因片段的重組質粒，敏感性高于PCR方法10倍；特異性試驗中，LAMP方法和PCR方法均顯示出了高度的特異性；在對127個臨床鼻拭子樣本的檢測中，LAMP方法檢測結果是所有樣本都為陽性，而PCR檢測出了116份陽性。證明所建立的方法，對臨床樣本的檢測的敏感度高于常規(guī)的PCR法。李鵬等根據(jù)GenBank中登錄的Mhp的核苷酸序列，設計4條特異性引物，用外引物進行PCR反應，對內外引物濃度、dNTP＋和MgSO4濃度及BstDNA聚合酶用量等進行優(yōu)化，建立MhpLAMP檢測方法，應用該方法檢測多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、肺炎雙球菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌和鏈球菌均呈陰性；當Mhp的拷貝數(shù)高于3時，均可檢測到該病原體。LAMP方法快速、靈敏、特異、無需特殊的儀器，為基層實驗室Mhp的檢測提供了簡單快速的方法，特別適合基層實驗室或養(yǎng)殖場在臨床中應用。

6 結語

病原的快速而準確的診斷是解決當今威脅畜牧業(yè)的各類傳染病的決定性因素。用于豬支原體肺炎的診斷方法很多，實時熒光定量敏感性比常規(guī)PCR和套氏PCR高，但同時對操作人員、儀器設備與試劑要求太高，一般實驗室很難具備試驗條件。ELISA方法具有敏感性和特異性強、操作簡單、檢測快速、重復性好、無輻射、準確性高的優(yōu)點，適合基層進行大批量檢測。LAMP特異性強、靈敏性高、成本低、不需要PCR儀，僅需要一個恒溫水浴鍋即可完成核酸的擴增，特別適合基層部門應用。無論哪一種方法都不能徹底解決所有的問題，可以根據(jù)試驗的目的和要求，選擇最適宜的檢測方法或將幾種檢測方法組合起來應用，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療、力爭從根本上解決該病的防控問題。隨著分子生物學進一步發(fā)展，相信一些特異性強、靈敏性高、簡便易行的新型診斷方法終將問世并得以推廣應用。