細粒棘球蚴（Echinococcus granulosus）CO1與ND1基因序列分析

于晶峰，譚 偉，李 濱，劉曉松，常建華，楊曉野，王 瑞，楊蓮茹，李秀霞

2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，呼和浩特 010031；

3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，呼和浩特 010110

細粒棘球蚴病，又名包蟲病，是世界廣泛分布的人獸共患性寄生蟲病[1－2]，對感染動物的肉產(chǎn)量、肉品質(zhì)、產(chǎn)奶量及后代繁殖均有嚴重影響[3]，更重要的是該病對人類的健康也構(gòu)成了嚴重的威脅[4－7]，因此一直倍受國內(nèi)外學者的關(guān)注。近年來，相關(guān)學者已在基因水平上對細粒棘球蚴的蟲株的遺傳變異進行了研究。

據(jù)報道，蟲株的遺傳變異可能會影響到生理周期模式、宿主的特異性、感染性、抗原性、傳播動力學、治療藥物的敏感性、致病性、診斷結(jié)果、流行病學和防控措施[8]。因此，確定蟲株對制定棘球蚴病的預(yù)防和控制策略具有十分重要的意義。細粒棘球絳蟲蟲株的鑒定比較復(fù)雜，以往主要是以其成蟲和幼蟲的形態(tài)學特征，結(jié)合生物學、生物化學、同工酶分析和流行病學等方面的資料，作為蟲株鑒別的依據(jù)。雖然形態(tài)學和生物學特征可為細粒棘球絳蟲蟲株鑒定提供很有價值的資料，但是由于受宿主和環(huán)境多種因素的影響，并不能反映不同蟲株之間基因水平上的差異。近年來分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，極大地促進了人們對細粒棘球絳蟲蟲株基因型鑒定的研究。眾所周知，線粒體DNA（mtDNA）具有進化率快、重組率低、獨立進化和基因組精簡等特點[9－10]，可作為重要的分子標記，用于生物種群的遺傳變異研究，尤其適于種以下水平的分類研究[11]。細粒棘球絳蟲的線粒體基因組共編碼2個核糖體RNA（12S、16S）、22 個 tRNA、1 個 細 胞 色 素 b（Cytb）、3 個 細 胞 色 素 氧 化 酶 亞 基 （CO1、CO2、CO3）、NADH氧化還原酶6個亞基的基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND6）和 ATP酶一個亞基的基因（ATPase6）[12]。其中編碼呼吸鏈的細胞色素c氧化酶和NADH氧化還原酶普遍存在于原核生物和真核生物細胞的線粒體中，是線粒體基因組中進化速率較慢的，可用以比較其在進化上的相互關(guān)系[13]。

鑒于以上因素，本研究以內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西烏旗地區(qū)檢獲的羊株和錫林浩特市地區(qū)檢獲的人株細粒棘球蚴作為研究對象，對其CO1與ND1基因的部分序列分別進行分析，并將兩種序列與Gen－Bank中已報道的細粒棘球蚴CO1和ND1基因相應(yīng)序列進行比對，目的在于明確這些地區(qū)不同動物宿主間細粒棘球蚴種株的基因型和遺傳變異情況及不同地理株之間的基因差異，這對了解家畜和人細粒棘球蚴病的感染來源以及不同宿主間的傳播鏈并制定不同地區(qū)細粒棘球蚴病的具體防控措施，具有重要參考意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 細粒棘球蚴包囊采自于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西烏旗綿羊和錫林浩特市某醫(yī)院細粒棘球蚴病患者。將采集的樣本用注射器將囊液吸出，離心1min使囊液與原頭蚴分離，－20。C條件下保存。

1.1.2 菌種、載體及主要試劑 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、DNA提取試劑盒（DNeasy Blood ＆Tissue Kit）和DNA凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit），購自北京市天根生化科技有限公司；Premix Taq、pMD19－T 載體、DL2000DNA Marker、氨芐青霉素（Amp）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D半 乳 糖 苷 （X－gal）、異 丙 基－β－D－硫 代 半 乳 糖 苷（IPTG）、10×Loading Buffer，均購自大連寶生物工程有限公司；核酸染料，購自北京市賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取實驗室保存的細粒棘球蚴原頭蚴，按照動物基因組DNA提取試劑盒說明書，提取基因組DNA，并置于－20。C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CO1與ND1基因擴增 以細粒棘球蚴DNA 為 模 板，用 上 游 引 物 5′－TTGTTAGGTGGTTTGTCTGA－3′和下游引物5′－GGCCATCATCAAATAAACAT－3′，擴增 CO1 基因部 分 序 列，PCR反應(yīng)體系為50μL，內(nèi)含Permix Taq 25μL，上下游引物各1.5μL，模板5μL，加dH2O補足至50 μL。同時，設(shè)置不加DNA模板的陰性對照。PCR擴增條件為：94。C預(yù)變性5min后，進入循環(huán)；即95。C變性1min，45。C退火45s，72。C延伸70s，共進行35個循環(huán)；最后72。C延伸10min。

同樣以細粒棘球蚴DNA為模板，用上游引物5′－GGTGGTTGTTTTTGGGTTAG－3′和下游引物5′－GTTTGCTATTGTTAATTAA－3′，擴 增 ND1基因部分序列。PCR反應(yīng)體系為同上，同時設(shè)陰性對照。PCR條件為：94。C預(yù)變性5min，95。C變性1min，50。C退火50s，72。C延伸70s，共進行35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后以72。C繼續(xù)延伸10min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化、克隆與測序 利用膠回收試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物的目的片段進行膠回收，將回收的CO1基因與ND1基因PCR擴增產(chǎn)物分別與pMD19－T載體連接。然后，將鏈接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，再分別涂布于LB固體培養(yǎng)基（含有 Amp、IPTG、X－gal）表面，37。C恒溫培養(yǎng)12h～16h，后置4。C冰箱顯色1h～2h。挑取數(shù)個白色菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37。C、180r／min振蕩培養(yǎng)過夜，菌液經(jīng)PCR鑒定后，將陽性菌液送至中美泰和公司測序。

2 結(jié) 果

2.1 CO1與ND1基因PCR擴增 細粒棘球蚴CO1和ND1基因分別經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，在約936bp、895bp處呈現(xiàn)特異性條帶，與目的片段大小基本一致，且無非特異性擴增條帶產(chǎn)生，擴增結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 細粒棘球蚴CO1基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of CO1gene fromEchinococcus granulosus

圖2 細粒棘球蚴ND1基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of ND1 gene fromEchinococcus granulosus

2.2 CO1與ND1基因測序結(jié)果 西烏旗羊株細粒棘球蚴CO1基因與錫林浩特市人株細粒棘球蚴CO1基因片段大小均為936bp，其A、T、G、C含量分別為15.71%、24.89%、48.72%、10.68%和15.60%、25.11%、47.54%、11.75%。

西烏旗羊株細粒棘球蚴ND1基因與錫林浩特市人株細粒棘球蚴ND1基因片段大小均為895bp其 A、T、G、C 含量分別為 19.44%、25.92%、46.59%、8.04% 和 19.44%、25.92%、46.82%、7.82%。

2.3 CO1基因序列比對結(jié)果 比對結(jié)果顯示：西烏旗羊株細粒棘球蚴CO1基因與錫林浩特市人株細粒棘球蚴CO1基因分別同GenBank中已登錄的新疆羊株細粒棘球蚴的CO1基因序列相比，相應(yīng)區(qū)域同源性分別存在6個和13個變異位點，突變類型均為轉(zhuǎn)換，即G與A置換和T與C置換；同源性分別為99.3%、98.6%（圖3）。

圖3 不同地理樣本間CO1基因序列同源性比較Fig.3 Homology of CO1gene sequences from different areas

2.4 ND1序列比對結(jié)果 利用DNAStar5.0中的MegAlign工具對ND1基因的序列進行分析，結(jié)果顯示：西烏旗羊株細粒棘球蚴的ND1基因序列與國內(nèi)外已報道的G1型ND1基因序列完全相同；錫林浩特人株細粒棘球蚴的ND1基因序列與G1型ND1基因序列存在2個變異位點，全部為T與C轉(zhuǎn)換；西烏旗羊株細粒棘球蚴和錫林浩特人株細粒棘球蚴均為G1基因型。

3 討 論

現(xiàn)有研究表明，動物mtDNA按照嚴格的母性遺傳方式傳代，分子量小，拷貝數(shù)多，基因的堿基替代率比單拷貝的核DNA基因組快5～10倍，進化速率很快，其中CO1基因和ND1基因相當保守，表現(xiàn)為不同程度的種內(nèi)遺傳差異和種間差異。因此，CO1基因和ND1基因可用于動物性寄生蟲的鑒 定 和 不 同 地 理 株 的 區(qū) 分[14－15]。 李 明 偉 等（2005）[16]對犬弓首蛔蟲的CO1基因部分序列進行了測序，結(jié)果表明不同地方蟲株的CO1基因表現(xiàn)出一定的差異性。劉國華等（2009）用不同地區(qū)的泡狀帶絳蟲的CO1基因序列與GenBank中報道的泡狀帶絳蟲的CO1基因序列進行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者CO1基因序列無差異[17]。本研究對西烏旗羊株細粒棘球蚴和錫林浩特人株細粒棘球蚴CO1基因進行了測序，并將兩株細粒棘球蚴CO1基因與新疆株細粒棘球蚴的CO1基因進行了比較。從序列對比結(jié)果可看出，西烏旗羊株細粒棘球蚴和錫林浩特人株細粒棘球蚴的CO1基因與新疆株細粒棘球蚴的CO1基因同源性很高，分別為99.3%、98.6%。

細粒棘球絳蟲對中間宿主有廣泛的適應(yīng)性，但在長期進化演變的過程中，蟲體與宿主之間在相互適應(yīng)中也發(fā)生著變異。以往以形態(tài)學特征為主的蟲株鑒定依據(jù)受到多種因素（如宿主和環(huán)境）的影響，并不能完全反映其基因水平的差異；而基于DNA序列的分析可直接鑒定生物體的不同種、亞種及地理株，能避免宿主和環(huán)境等因素的影響[18]，ND基因是常用的分型基因。國內(nèi)外學者根據(jù)基因型的差異，將細粒棘球絳蟲分為10個基因型，即G1～G10。不同基因型蟲株對人的感染性和致病性有差別，G1、G2、G3、G5、G6、G7、G8、G9均可感染人，其他基因型蟲株對人的致病性有待進一步研究。不同基因型蟲株間的核苷酸都有不同程度的差異，如G2和G3與G1間的核苷酸差異很小，被稱為細粒棘球絳蟲的狹義種；G4與其它蟲株間的核苷酸差異在10%，G5與其它蟲株間的核苷酸差異在6%以上；G6、G7、G8、G9、G10與 G1間的核苷酸差異超過10%。楊俊克（2004）[19]對我國三省區(qū)（青海省、甘肅省和新疆維吾爾族自治區(qū)）細粒棘球蚴基因變異的情況進行了分析，由檢測結(jié)果可知，各地區(qū)分離株ND1基因的變異率為0.1%～0.7%，均屬于G1基因型。本研究對內(nèi)蒙古兩地區(qū)的細粒棘球蚴蟲株進行了測序，經(jīng)DNAStar5.0軟件分析可知，兩地區(qū)細粒棘球蚴均為G1型，以上數(shù)據(jù)表明，這些地區(qū)人的細粒棘區(qū)病有可能通過綿羊—犬—人方式進行傳播流行，需要加以注意和防控。

綜上所述，本次研究所得的西烏旗羊株細粒棘球蚴和錫林浩特市人株細粒棘球蚴的CO1基因與新疆株細粒棘球蚴的CO1基因相比均有變異位點，突變類型為轉(zhuǎn)換，即不同地理株細粒棘球蚴CO1基因的部分序列略有不同；但在ND1基因方面，與新疆株相比，西烏旗羊株細粒棘球蚴ND1基因序列無變異位點，而錫林浩特市人株細粒棘球蚴ND1基因序列存在2個變異位點，全部為T與C轉(zhuǎn)換。上述研究結(jié)果，為確定細粒棘球絳蟲在內(nèi)蒙古某些地區(qū)的流行蟲株基因型及其可能的傳播鏈情況提供了重要依據(jù)。

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