益母草提取物對阿霉素心肌損傷的防護作用

陳瑜萍

摘 要 目的：研究益母草提取物對阿霉素所致的心肌受損細胞的保護作用。方法：以MTT法將H9C2心肌細胞置于（36.5±0.5）℃， 95%空氣加5%二氧化碳混合氣體中培養。實驗組心肌細胞培養液中加益母草提取液和阿霉素；對照組加阿霉素；對照空白組兩者都不加。結果：實驗組細胞存活率為63.4%，對照組細胞存活率為48.5%，組間差異有統計學意義（P<0.05）。結論：益母草提取物對阿霉素所致的心肌受損細胞具有保護作用。

關鍵詞 益母草 阿霉素 心肌損傷

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：B 文章編號：1006-1533（2014）21-0052-03

The protective effect of the extracts of Leonurus artemisia

on the adriamycin-induced myocardial injury

CHEN Yuping

（Kangjian Community Health Service of Xuhui District， Shanghai 200233， China）

ABSTRACT Objective： To study the cytoprotective effect of the extracts of Leonurus artemisia on adriamycin-induced myocardial damage. Methods： Myocardial H9C2 cells were cultivated at （36.5±0.5） ℃ in an incubator with 95% air and 5% carbon dioxide based on MTT assay and the extracts of Leonurus artemisia were added into the broth of myocardial cells in the experimental group， while only adriamycin in the control group and neither the extracts of Leonurus artemisia nor adriamycin in the blank control group and then cells were incubated for 24 hours at 37 ℃. Results： The survival rate of cells was 63.4% in the experimental group while only 48.5% in the control group （P<0.05）. Conclusion： The extracts of Leonurus artemisia have a protective effect on adriamycin-induced myocardial injury cells.

KEY WORDS Leonurus artemisia；adriamycin；myocardial injury

阿霉素（ adriamycin， ADM）是抗腫瘤藥物，抗腫瘤譜廣，療效顯著，但是，阿霉素具有一定的心臟毒性。益母草（Leonurus heterophyllus， LH）有效成分為LH 堿等生物堿，其功用主治為活血化瘀、利尿、調經，臨床上主要用于婦產科。近期研究認為，益母草的藥理作用是多方面的，臨床上有用于冠心病心肌缺血取得良好效果的報道。我們研究了益母草對阿霉素造成的心肌缺血及再灌注損傷的作用，結果如下。

材料與方法

材料

細胞及試劑

H9C2心肌細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS），噻唑蘭試劑（MTT），4%多聚甲醛，Hoechst 33258染色液，二甲基亞砜（DMSO），DMEM培養基。

儀器

熒光顯微鏡（Leica），酶標儀（Infinire Mzoo型，TECAN公司），CO2孵箱（Thermo Electron Corporation型，JOUAN公司）。

方法

細胞培養

將H9C2心肌細胞置于pH為7.2～7.4，溫度為（36.5±0.5）℃，95%空氣加5%二氧化碳混合氣體的環境中培養。

實驗分組

將實驗分為3組：空白對照組為沒有加入阿霉素和益母草提取物的細胞組，對照組為加入1 μmol/L阿霉素的細胞組，實驗組為先加入100 μg/ml的益母草提取物后再加入1 μmol/L的阿霉素的細胞組。

MTT法

將H9C2細胞加入96孔培養板，每孔4 000個細胞，培養24 h，去血清，在37 ℃孵箱下繼續培養24 h ，加入益母草，1 h后再加入1 μmol/L的阿霉素，培養24 h，每孔加入10 μl含5 mg/ml 的MTT，4 h后加入150 μl的二甲基亞砜。在酶標儀上波長490 nm下測定OD值，每組通過篩選后各留下8個OD值。

Hoechst 33258細胞核染色

取潔凈載玻片在70%乙醇中浸泡5 min或更長時間，無菌超凈臺內吹干或用無菌的PBS或0.9% NaCl溶液洗滌3遍，再用細胞培養液洗滌1遍，將載玻片置于6孔板內，種入細胞培養過夜。刺激細胞發生凋亡后，吸盡培養液，加入0.5 ml固定液，固定15 min或更長時間（可4 ℃過夜）。去固定液，用PBS或0.9% NaCl洗2遍，每次3 min，吸盡液體。洗滌時用搖床或手動晃動，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色30 min。去染色液，用PBS或0.9% NaCl洗2遍，每次3 min，吸盡液體。洗滌時用搖床或手動晃動，加1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的載玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞液，激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右。

統計學方法

采用SPSS 10.0統計軟件，計量資料采用卡方檢驗，計數資料采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

結果

MTT法實驗結果

用酶標儀檢測各組細胞的吸光值A570和 A490， 以 A570/A490代表細胞活力，空白對照組細胞存活率為 100%，其余各組按存活率 = （各濃度組吸光值 /空白對照組吸光值） ×100%與之比較。阿霉素對照組平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物組平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258細胞核染色實驗結果

3個組在400倍的熒光顯微鏡觀察到的結果見圖1。

從圖1中我們可以看見，A為正常細胞，有橢圓形的細胞核；B為加入阿霉素的細胞， 細胞核發生固縮，呈典型的凋亡改變； C則顯示通過益母草提取物的加入，細胞的受損程度遠好于B組，說明益母草提取物的加入對阿霉素的心肌受損細胞具有保護作用。

討論

本實驗提示，僅加阿霉素的心肌細胞平均存活率為48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌細胞平均存活率為63.4%，比前者高。從Hoechst 33258細胞核染色實驗結果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌細胞的受損程度比不加益母草提取物的細胞要低， 這就說明了益母草提取物的加入對心肌細胞的存活是有幫助的，能明顯降低心肌細胞的死亡率。

從文獻[1]來看，阿霉素的心臟毒性是由其半醒自由基介導的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂質過氧化反應增強，損傷細胞膜及細胞器膜，改變膜上蛋白質的功能及酶的活性，導致細胞內鈣超載，核酸、蛋白質合成受抑制，能量代謝障礙，嚴重影響心肌的收縮及舒張功能。益母草主要成分為益母草堿， 具有調經活血、興奮子宮等作用， 主要用于婦科疾病。近年來許多研究表明，益母草的藥理作用是多方面的。益母草注射液試用于治療冠心病已有文獻報道[2]。臨床研究[3]及實驗研究均表明， 心肌缺血可使機體脂質過氧化反應增強， 血漿丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血漿MDA升幅低于阿霉素組， 全血谷胱甘肽過氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素組， 說明益母草對清除自由基系統酶的活性有保護作用， 可減少脂質過氧化反應， 減輕心肌細胞膜由氧自由基引發的損傷， 減低細胞膜的通透性， 從而減少心肌細胞內心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌細胞內，減輕心肌細胞內Ca2+ 超載引起的細胞損傷。本實驗的結果亦顯示，益母草提取物對阿霉素的心肌損傷有明顯保護作用。

參考文獻

夏臘梅， 伍杰雄. 川芎嗪對大鼠心肌線粒體損傷的保護作用[J]. 中國藥房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何錫文. 復方生脈飲對羥自由基的清除作用研究[J]. 中國中藥雜志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力體保對阿霉素所致大鼠心肌線粒體毒性的保護作用[J]. 中華醫學研究雜志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）

統計學方法

采用SPSS 10.0統計軟件，計量資料采用卡方檢驗，計數資料采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

結果

MTT法實驗結果

用酶標儀檢測各組細胞的吸光值A570和 A490， 以 A570/A490代表細胞活力，空白對照組細胞存活率為 100%，其余各組按存活率 = （各濃度組吸光值 /空白對照組吸光值） ×100%與之比較。阿霉素對照組平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物組平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258細胞核染色實驗結果

3個組在400倍的熒光顯微鏡觀察到的結果見圖1。

從圖1中我們可以看見，A為正常細胞，有橢圓形的細胞核；B為加入阿霉素的細胞， 細胞核發生固縮，呈典型的凋亡改變； C則顯示通過益母草提取物的加入，細胞的受損程度遠好于B組，說明益母草提取物的加入對阿霉素的心肌受損細胞具有保護作用。

討論

本實驗提示，僅加阿霉素的心肌細胞平均存活率為48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌細胞平均存活率為63.4%，比前者高。從Hoechst 33258細胞核染色實驗結果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌細胞的受損程度比不加益母草提取物的細胞要低， 這就說明了益母草提取物的加入對心肌細胞的存活是有幫助的，能明顯降低心肌細胞的死亡率。

從文獻[1]來看，阿霉素的心臟毒性是由其半醒自由基介導的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂質過氧化反應增強，損傷細胞膜及細胞器膜，改變膜上蛋白質的功能及酶的活性，導致細胞內鈣超載，核酸、蛋白質合成受抑制，能量代謝障礙，嚴重影響心肌的收縮及舒張功能。益母草主要成分為益母草堿， 具有調經活血、興奮子宮等作用， 主要用于婦科疾病。近年來許多研究表明，益母草的藥理作用是多方面的。益母草注射液試用于治療冠心病已有文獻報道[2]。臨床研究[3]及實驗研究均表明， 心肌缺血可使機體脂質過氧化反應增強， 血漿丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血漿MDA升幅低于阿霉素組， 全血谷胱甘肽過氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素組， 說明益母草對清除自由基系統酶的活性有保護作用， 可減少脂質過氧化反應， 減輕心肌細胞膜由氧自由基引發的損傷， 減低細胞膜的通透性， 從而減少心肌細胞內心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌細胞內，減輕心肌細胞內Ca2+ 超載引起的細胞損傷。本實驗的結果亦顯示，益母草提取物對阿霉素的心肌損傷有明顯保護作用。

參考文獻

夏臘梅， 伍杰雄. 川芎嗪對大鼠心肌線粒體損傷的保護作用[J]. 中國藥房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何錫文. 復方生脈飲對羥自由基的清除作用研究[J]. 中國中藥雜志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力體保對阿霉素所致大鼠心肌線粒體毒性的保護作用[J]. 中華醫學研究雜志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）

統計學方法

采用SPSS 10.0統計軟件，計量資料采用卡方檢驗，計數資料采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

結果

MTT法實驗結果

用酶標儀檢測各組細胞的吸光值A570和 A490， 以 A570/A490代表細胞活力，空白對照組細胞存活率為 100%，其余各組按存活率 = （各濃度組吸光值 /空白對照組吸光值） ×100%與之比較。阿霉素對照組平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物組平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258細胞核染色實驗結果

3個組在400倍的熒光顯微鏡觀察到的結果見圖1。

從圖1中我們可以看見，A為正常細胞，有橢圓形的細胞核；B為加入阿霉素的細胞， 細胞核發生固縮，呈典型的凋亡改變； C則顯示通過益母草提取物的加入，細胞的受損程度遠好于B組，說明益母草提取物的加入對阿霉素的心肌受損細胞具有保護作用。

討論

本實驗提示，僅加阿霉素的心肌細胞平均存活率為48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌細胞平均存活率為63.4%，比前者高。從Hoechst 33258細胞核染色實驗結果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌細胞的受損程度比不加益母草提取物的細胞要低， 這就說明了益母草提取物的加入對心肌細胞的存活是有幫助的，能明顯降低心肌細胞的死亡率。

從文獻[1]來看，阿霉素的心臟毒性是由其半醒自由基介導的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂質過氧化反應增強，損傷細胞膜及細胞器膜，改變膜上蛋白質的功能及酶的活性，導致細胞內鈣超載，核酸、蛋白質合成受抑制，能量代謝障礙，嚴重影響心肌的收縮及舒張功能。益母草主要成分為益母草堿， 具有調經活血、興奮子宮等作用， 主要用于婦科疾病。近年來許多研究表明，益母草的藥理作用是多方面的。益母草注射液試用于治療冠心病已有文獻報道[2]。臨床研究[3]及實驗研究均表明， 心肌缺血可使機體脂質過氧化反應增強， 血漿丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血漿MDA升幅低于阿霉素組， 全血谷胱甘肽過氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素組， 說明益母草對清除自由基系統酶的活性有保護作用， 可減少脂質過氧化反應， 減輕心肌細胞膜由氧自由基引發的損傷， 減低細胞膜的通透性， 從而減少心肌細胞內心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌細胞內，減輕心肌細胞內Ca2+ 超載引起的細胞損傷。本實驗的結果亦顯示，益母草提取物對阿霉素的心肌損傷有明顯保護作用。

參考文獻

夏臘梅， 伍杰雄. 川芎嗪對大鼠心肌線粒體損傷的保護作用[J]. 中國藥房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何錫文. 復方生脈飲對羥自由基的清除作用研究[J]. 中國中藥雜志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力體保對阿霉素所致大鼠心肌線粒體毒性的保護作用[J]. 中華醫學研究雜志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）