不同品種（系）烤煙西柏三烯二醇代謝差異研究

王冬，孫九哲，彭玉富，張小全，李麗華，宋洋洋，楊鐵釗

1河南農業大學，煙草學院，鄭州市文化路95號 450002；

2河南中煙工業公司，技術中心，鄭州市隴海東路72號 450002

農藝與調制

不同品種（系）烤煙西柏三烯二醇代謝差異研究

王冬1，孫九哲2，彭玉富2，張小全1，李麗華1，宋洋洋1，楊鐵釗1

1河南農業大學，煙草學院，鄭州市文化路95號 450002；

2河南中煙工業公司，技術中心，鄭州市隴海東路72號 450002

為闡明煙草西柏三烯二醇代謝機理，采用GC-MS測定了8306、12451、云煙87、Y892×8306、豫煙11號、NX232和中煙100，7個烤煙品種（系）中部葉齡60 d葉面分泌物組分，并對其中具有代表性的4個材料的西柏三烯二醇合成關鍵酶基因CYC-1和CYP71D16進行了熒光定量PCR測定，對生育期葉面分泌物的變化、調制后煙葉茄酮含量和感官質量進行了分析評價。結果表明，7個烤煙品種（系）中部葉葉齡60 d時煙葉的葉面分泌物中，共測定出13種非揮發性化合物，主要成分為西柏三烯二醇；8306具有最高的葉面分泌物和西柏三烯二醇含量，豫煙11號次之，12451最低；CYC-1和CYP71D16在8306中的相對表達量顯著高于12451和云煙87，初步說明這兩個基因的上調表達促進了西柏三烯二醇的合成。成熟期具有較大西柏三烯二醇降解量的8306和豫煙11號在調制后擁有更高的茄酮含量。

烤煙；葉面分泌物；西柏三烯二醇；茄酮；品種

煙草葉面分泌物與香氣關系密切。有研究人員曾對成熟期烤煙進行葉面分泌物的浸提，發現葉面分泌物的缺失對烤煙香味成分和感官質量均產生了負面影響[1]。煙葉的某些特征香氣來源于葉面分泌物及其降解產物或衍生物，是構成煙葉品質的重要組成部分，而且能充分體現出品種的差異性[2-4]。因此，葉面分泌物研究對提高烤煙品質和促進煙草品質育種均具有重要意義。煙草葉面分泌物是煙草香味和香氣組分的重要前體物，某些品種葉面分泌物可占煙葉干重的10%[5]。幾類主要的葉面分泌物成分是：類西柏烷和類賴百當二萜、糖酯、表面蠟以及一些微量成分（包括揮發性物質、N-羥酰基降煙堿、西柏烯和一些金屬元素等）[6]。對于烤煙來說，西柏三烯二醇是煙葉葉面分泌物的主要成分，能占到分泌物總量60%左右[7]，并在調制后大部分降解產生茄酮及其衍生物等多種香味成分[8]。在煙草中，西柏三烯二醇的合成反應大致分為兩步：首先在西柏三烯醇環化酶的作用下，香葉基香葉基焦磷酸發生環化反應，形成西柏三烯一醇[9]；然后經過細胞色素P450羥化酶的作用，西柏三烯一醇的第6位碳發生羥化反應形成西柏三烯二醇[10]。

目前，編碼西柏三烯醇環化酶（CYC-1，Genebank Accession No.AY049090）[7]和編碼細胞色素P450羥化酶（CYP71D16，GenBank Accession No.AF166332）[10]的基因已經相繼得到了確定。研究表明，影響煙葉表面分泌物特點的因素有很多，包括煙草生長所處的水肥條件等[11]，但其最主要影響因素是煙草的遺傳構成[1,12-13]。

近年來，對煙葉表面分泌物已有不少研究，但多數仍停留在品種間對比、影響因素和調控措施上，對葉面分泌物代謝過程中的關鍵基因以及調制后相關代謝產物的變化方面的研究目前還不多見。本研究從改良煙草葉面分泌物入手，通過對代謝過程關鍵基因表達情況的測定，初步闡明了造成品種（系）間葉面分泌物含量差異的原因，并結合煙葉成熟后葉面分泌物的降解情況和感官評價結果，探討了不同品種（系）烤煙成熟過程中煙葉表面香氣物質的變化規律，以期為煙草品質育種工作提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料及設計

供試材料為8306、12451、云煙87、Y892×8306、豫煙11號、NX232和中煙100共7個品種（系）。試驗于2012年在河南省禹州市進行，5月2日移栽，采用常規施肥手段和田間管理措施。選定具有代表性的植株，自下而上標記1～22位可收葉，掛牌標記，并調查各品種中部葉（第10、11、12位）葉齡（葉片生長至2～3 cm長度時開始計算葉齡）。各品種在中部葉葉齡60d時和成熟采收時（同時期保留殺青樣）取樣2片，樣品遮光干冰保存運送到實驗室測量葉面積后進行RNA提取和葉面分泌物的提取；田間煙葉成熟采烤后取具代表性等級（B2F和C3F）烤后煙葉備測。

1.2 煙葉葉面分泌物組分的測定

煙葉葉面分泌物采用美國Thermo Fisher Scientific公司的TRAVE GC ULTRA–DSQ ⅡMS型氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀進行定性定量測定。

葉面分泌物的提取和濃縮：將1000 mL左右二氯甲烷倒入金屬托盤（清潔無水殘留）中，用鑷子夾住葉柄基部將葉片整片浸入二氯甲烷溶液中2秒鐘，將葉片提出溶液2秒，使葉片上的二氯甲烷滴回到盤中，這樣算作浸提一次，每片葉片反復浸提4次，最后一次浸提后需要將葉片上的二氯甲烷完全滴回盤中。

將托盤中所有的二氯甲烷轉移到2000 mL的燒杯中，向燒杯中加入1 mL的內標（內標為1.01 g蔗糖八乙酸酯和1.271 g正-17-烷醇，定容500 mL），充分混勻，加入10 g左右無水硫酸鈉，充分攪拌吸去水分，用定量濾紙過濾至1000 mL圓底燒瓶中，濾液減壓旋轉蒸發至20 mL左右，最后定容至50 mL容量瓶。

用移液管取5 mL上述浸提液于色譜瓶中，在氮氣保護下將溶劑吹干。加入500 μL 1:1 (v:v)DMF:BSTFA，在75℃水浴中進行衍生化反應60 min，加入0.5 mL的二氯甲烷溶解不溶物，即為GC/MS分析樣品液。

氣質聯用儀反應條件：GC條件：色譜柱：DB-5MSUI石英毛細管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；進樣口溫度：250℃；程序升溫：40℃保持2 min ,然后以6℃/min升溫至180℃保持2min,以2℃/min升溫至280℃保持20 min；載氣：高純氦氣，載氣流速：恒流0.8 mL/min；進樣量：1.0 μL，分流比：15:1；MS條件：傳輸線溫度：250℃；EI離子源溫度：280℃；電離能量：70 eV；質量數范圍50-650 amu；檢索譜庫：NIST08。

1.3 熒光定量PCR

以煙草Actin基因（Genebank Accession No.AB158612）為內參，引物序列為Actin-F:5’GCTGTTTTTCCTAGTATTGTTGGTC-3’，Actin-R: 5’-AATACCTGTTGTACGGCCACTG-3’；CYC-1（Genebank Accession No.AY049090）引物為F:5’-CGAGGGTGGGATCAAGGAAATACA-3’，R:5’-ATCGCATCCGTGAAAAGCATAAG-3’；CYP17D16（GenBank Accession No.AF166332）引物為F:5’-ATGGACCAATTATGCACCTTCAACT-3’，R:5’-GGCACTGAGCAATTCCAAGAGACA-3’。進行熒光定量PCR測定，反應體系與程序設置見表1和表2。采用Prizm4統計分析軟件進行數據統計分析。

表1 熒光定量PCR體系配置（20 μL體系）Table 1 System configuration of Real-Time PCR (20 μL system)

表2 PCR反應程序設置Table 2 PCR reaction procedure

2 結果與分析

2.1 葉面分泌物含量生育期變化趨勢分析

由圖1可以看出，各材料中部葉葉面分泌物含量在生育期呈雙峰線變化趨勢，在葉齡30 d時達到第一個峰值，40 d時又有所降低，然后逐漸升高至60 d達到最高峰值，此時材料間差異也最明顯，進入成熟期葉面分泌物含量逐漸下降。就材料間來看，8306腺毛分泌物總量在整個生育期始終高于其它材料，云煙87和12451在各葉齡期腺毛分泌物含量均處于較低水平， 當煙葉進入成熟期時，各參試材料葉面分泌物含量差異有逐漸縮小的趨勢。

圖1 不同葉齡煙葉腺毛分泌物總量Fig.1 Variations in trichome exudates content in tobacco leaves with leaf age

2.2 中部葉葉齡60 d葉面分泌物組分分析

由于各材料葉面分泌物含量在葉齡60 d時差異最明顯，因此對葉齡60 d時各品種（系）葉面分泌物進行了GC-MS檢測分析，結果如表3所示。

表3 各品種（系）烤煙中部葉葉齡60 d葉面分泌物組分含量Table 3 GC-MS analysis of the trichome exudates components (60 days)

續表3

通過對各品種（系）中部葉葉齡60 d時葉面分泌物的測定，共檢測出13種化合物，包括西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及其同分異構體、烷烴類、蔗糖酯、酚類、其它醇類以及葉面浸出的煙堿。可以看出，西柏三烯二醇是這7個烤煙品種（系）葉面分泌物的主要成分，分別占葉面分泌物總量的41.49 %～81.09 %。因此，西柏三烯二醇為葉面分泌物中最主要的香味物質，在葉面化合物對煙葉香味的貢獻中起決定性作用；而其它檢測出的化合物種均不是葉面分泌物的主要成分，但這些含量較少的化合物共同作用構成了不同烤煙品種（系）間特殊的香味風格。其中，由GC-MS檢測出的煙堿為煙葉葉面浸出的部分物質，不能表現煙葉內部煙堿含量的真實情況。從品種（系）間來看，8306具有最高的葉面分泌物總量，其次是豫煙11號，12451最低，而西柏三烯二醇含量也符合這一規律，8306的西柏三烯二醇含量高達67.53 μg·cm-2，豫煙11號為 54.58 μg·cm-2，而 12451 和云煙 87還不足8306的一半；烷烴類物質豫煙11號最高，云煙87次之，Y892×8306最低；蔗糖酯含量是8306最高，而豫煙11號最低。

2.3 CYC-1與CYP71D16基因相對表達量的品種（系）間差異分析

分別選取西柏三烯二醇含量最高和最低的8306和12451，以及常規品種云煙87和豫煙11號共4個材料進行CYC-1和CYP71D16的熒光定量PCR測定，結果見圖2。可以看出，CYC-1和CYP71D16在不同品種（系）煙草中表達量差異顯著，8306和豫煙11號中CYC-1和CYP71D16的表達量顯著高于12451和云煙87。這樣的結果進一步證明了煙草葉面分泌物中的主要成分西柏三烯二醇的形成與這兩個基因的表達情況密切相關，CYC-1和CYP71D16的上調表達是造成8306和豫煙11號的西柏三烯二醇含量較高的主要原因。

圖2 葉齡60 d時CYC-1、CYP71D16相對表達量Fig.2 Relative expressions of CYC-1 and CYP71D16 at the leaf age of 60 days

2.4 成熟期品種（系）間西柏三烯二醇降解差異分析

西柏三烯二醇的降解產物是煙草中含量最豐富的中性香味物質茄酮的來源。因此，繼續監測各參試材料成熟采收時期鮮葉葉面分泌物，并將兩次取樣中西柏三烯二醇含量進行作圖比較（圖3）；同時測定了葉齡60 d時和調制后煙葉中的茄酮含量（圖4）。

圖3 各品種（系）于葉齡60d時和成熟期西柏三烯二醇含量Fig.3 The content of CBT-diols at leafage of 60 days and mature period

根據檢測結果，相比于葉齡60 d，各品種（系）成熟期西柏三烯二醇含量均有所下降。與葉齡60 d時較大的含量差異不同，成熟后各品種（系）西柏三烯二醇含量相對接近，8306、12451、云煙87、豫煙11號、NX232和中煙100成熟期較葉齡60 d時西柏三烯二醇含量分別減少了66.25 %、16.95 %、18.63 %、57.40 %、33.79 %和19.28 %。其中，8306和豫煙11號在成熟過程中西柏三烯二醇降解量均超過50 %，明顯高于其它材料；而12451、云煙87和中煙100西柏三烯二醇降解量相對較低。

對煙葉中茄酮含量的測定結果（圖4）驗證了上述結論，不同品種（系）煙葉的西柏三烯二醇在成熟和調制過程中的生理代謝存在差異。葉齡60 d時，各材料煙葉茄酮含量接近，而調制后8306和豫煙11號的初烤煙葉中茄酮含量明顯高于其它品種（系）。這說明，大量的西柏三烯二醇在煙葉成熟后降解成為對香氣質量有重大貢獻的茄酮，在這個過程中8306和豫煙11號的西柏三烯二醇得到了更加充分的降解，具有更高的西柏三烯二醇降解能力；而降解量較少的12451和云煙87調制后煙葉中茄酮含量較低。

圖4 各品種（系）中部葉葉齡60d與調制后茄酮含量Fig.4 The content of solanone at leafage of 60 days and after flue-cured

2.5 感官質量評價

委托河南中煙對8306、12451、云煙87和豫煙11號這4個材料的中上部初烤煙葉進行了感官質量評價，結果見表4。

表4 初烤煙葉感官質量評分Table 4 Scores of sensory quality

可以看出，豫煙11號感官評吸總分最高，8306和云煙87次之，12451得分最低。其中8306香氣質較好、香氣量較足、煙氣濃度較足，但與其它品種（系）相比余味稍差、較重、刺激性較大；12451除香氣質得分較高之外，各項指標均表現一般；云煙87香氣飽滿、煙氣平淡，上部葉雜氣較重；豫煙11號香氣質較好、香氣量較足、香味特殊，無明顯缺點。

3 討論

Severson等[11]已全面地綜述了煙葉表面化學及表征各種成分性質的方法，并認為主要的幾類鮮煙葉表面非揮發性化合物是：類西柏烷和類賴百當二萜、蔗糖酯和表面蠟。目前得到大多數學者確認的對煙葉香味具有貢獻的重要化合物主要是類西柏烷類中的α-和β-西柏三烯二醇和賴百當類化合物中的冷杉醇、賴百當烯二醇等，而且西柏烷類和賴百當類二萜的含量通常位居最豐富的3類主要煙葉表面化合物之首[6,11,12]。其中賴百當類化合物為香料煙所獨有，是產生香料煙特征香氣的關鍵成分之一[12,14,15]。在本研究的7個烤煙品種（系）的葉面分泌物中，含量最高的非揮發成分均為西柏三烯二醇，而香料煙特有賴百當類物質則未被檢測出，這與前人的研究結果是基本一致的。與此同時本研究尚有少量未鑒定的成分，其中是否還存在未知的特征香氣成分，有待進一步研究。

楊鐵釗等[16]研究表明，生長過程中單位面積葉面的分泌物量呈雙峰曲線變化態勢，中部位葉面分泌物量在葉齡60 d時達到最大值，之后直至煙葉成熟，腺毛分泌物含量呈逐漸下降趨勢，而葉齡60 d時品種間差異也最大，是測定葉面分泌物量的最佳時期。本研究驗證了這一結論。參試的7個煙草品種（系）中，豫煙11號是課題組以MSK326為母本，以高香氣烤煙品系8306為父本雜交選育的烤煙雜交種；其父本8306是從煙草腺毛分泌物入手，把提高煙葉表面致香物質含量作為培育高香氣品種的一個突破口，培育出的高香氣烤煙新品系；試驗材料12451來自純合高香氣烤煙品系8306的干燥種子，于2008年搭載中國發射的返回式衛星太空飛行15 d，種子返回地面后經系統選育4代而成突變品系。在遺傳背景一致的情況下，經過太空變異，12451中部葉葉齡60d時的西柏三烯二醇含量比原始種8306有大幅度降低，甚至低于常規品種的水平。對比兩者西柏三烯二醇合成關鍵基因的相對表達量，8306的CYC-1和CYP71D16兩個基因的表達量顯著高于同遺傳背景的12451，也顯著高于常規品種云煙87。這一結果說明煙草西柏三烯二醇的合成直接受CYC-1和CYP71D16兩個基因表達情況的影響，造成8306西柏三烯二醇含量較高的原因是這兩個基因的顯著上調表達。

目前國內外關于煙葉中西柏三烯二醇的生物降解途徑的研究比較少，而得到眾多學者公認的降解產物主要成分是茄酮，在酶解或加熱等條件下，西柏三烯二醇降解，在鍵的斷裂過程中，得到了茄酮[8,17]。茄酮是煙草中的關鍵致香化合物，具有類似胡蘿卜的香味和甘草、茶樣芳香，經煙草的調制、陳化進一步降解后可產生對卷煙吃味有重要影響的茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等物質，其中降茄二酮具有弱的堅果香及甜香，在卷煙中可以明顯增加似可可和白肋煙一樣的香味[18]。在本研究中，相比于葉齡60 d時，各參試材料在成熟期西柏三烯二醇含量均有所降低，而8306和豫煙11號降解量明顯大于其它材料。在調制后，8306與豫煙11號也具有明顯較高的茄酮含量，這說明8306和豫煙11號在大田生長期積累的大量西柏三烯二醇更加充分地降解成茄酮。

關于茄酮含量對煙葉香氣質量的影響，目前研究結論不一，有研究表明，茄酮含量與煙葉吸食品質呈負相關[19]，如李富強等[20]研究發現，巴西、津巴布韋等進口優質煙葉的茄酮含量均顯著低于國內烤煙；然而也有與此相反的研究結論，如邵巖等[21]研究發現，云南上部煙葉的茄酮含量高于津巴布韋，而中部和下部煙葉的茄酮含量則明顯低于津巴布韋。由此可見，茄酮與煙葉質量的關系比較復雜，可能不符合簡單的直線相關關系。除此之外，茄酮還有可能受諸如基因型、生態條件[22]、烘烤工藝[23]等多種因素的影響，而且還有很多其它因素如生態條件和品種的適應性等均可能影響煙葉感官質量。因此，盡管在本研究中豫煙11號獲得了較高的評吸分數，但是不能據此斷定這一結果是由較高的茄酮含量所造成的，這一問題還有待于進一步深入研究。

煙葉表面分泌物的代謝受到多種因素的影響[24-25]。本次試驗只是探討了在河南煙區一定條件下部分烤煙品種葉面分泌物的組成以及主要成分的代謝情況，今后可以擴大研究范圍，討論在不同環境條件和栽培措施的影響下，煙草葉面分泌物的代謝變化及其對煙葉質量的影響。利用煙葉腺毛分泌物篩選和鑒定新的高香氣煙草種質資源，可以為煙草新品種的選育創造更多新型的特色煙材料，豐富卷煙工業的原料組成。

4 結論

煙草中部葉葉面分泌物含量在生育期呈雙峰線變化趨勢，葉齡60 d達到最高峰值，此時材料間差異最明顯；西柏三烯二醇是煙草葉面分泌物的主要成分；8306和豫煙11號葉面分泌物尤其是西柏三烯二醇含量明顯高于其他品種（系）；CYC-1和CYP71D16基因的表達情況與西柏三烯二醇的合成關系密切，其上調表達能夠促進西柏三烯二醇合成；煙葉成熟收烤后，西柏三烯二醇進一步降解為茄酮及其衍生物，對煙葉香氣質量有重要貢獻。

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Metabolism differences of cembratrien-diols in different tobacco cultivars

WANG Dong1,Sun Jiuzhe2,PENG Yufu2,ZHANG Xiaoquan1,LI Lihua1,SONG Yangyang1,YANG Tiezhao1
1 College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China；
2 Technology Center,China Tobacco Henan Industrial Corporation,Zhengzhou,450000,China

Compositions of leaf surface exudates of different tobacco varieties and changes of cembratrien-diols were studied,sensory quality of flue-cured tobacco leaves was also evaluated in order to provide an effective method of finding new tobacco species resources with special aroma.Surface exudates compositions in 60-day-age and mature stage cutters of 7 tobacco varieties,namely 8306,12451,Yunyan87,Y892×8306,Yuyan No.11,NX232 and Zhongyan100 were determined with GC-MS method.Expression level of CYC-1 and CYP71D16,solanone content and sensory quality in flue-cured tobacco leaves was analyzed.Results showed that 13 flavor substances in compositions of leaf surface exudates in 60-day-age cutters of the 7 tobacco varieties were detected with cembratriene-diols being the main substance.The content of cembratriene-diols,being the main flavor composition,varied among varieties with the highest content in 8306 at 60 days after leaf sprouting,followed by Yuyan No.11 and 12451.Expression level of CYC-1 and CYP71D16 in 8306 was significantly higher than that in 12451 and Yunyan87 while8306 and Yuyan No.11 had higher content of solanone.

flue-cured tobacco; leaf surface exudates; cembratriene-diols; solanone; varieties

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.06.010

S572.01 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）06-0063-07

本研究由中國煙草總公司科技重點項目（110201002008）

王冬（1985—），博士研究生，主要從事煙草遺傳育種研究,Email: wangdong0629@163.com

楊鐵釗（1955—），教授，博士生導師，主要從事煙草遺傳育種研究，Email: yangtiezhao@126.com

2013-11-27