cGVHD患者外周血中CD45RA+和CD45RO+T淋巴細胞亞群的特點及其臨床意義

羅 盈 王春苗 林 婷 羅燕飛 甘慧泉 周茂華

(廣東省醫學科學院/廣東省人民醫院，廣州 510000)

異基因造血干細胞移植(Allogeneic haematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前治愈惡性血液病最有希望的手段，其最終目標是通過供體來源的免疫效應細胞發揮移植物抗腫瘤(Graftversus-leukemia，GVL)效應清除異常克隆。但GVL往往伴隨移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)的發生，引起多臟器的損傷，免疫缺陷和感染。目前GVHD仍然是影響造血干細胞移植的療效，限制其臨床廣泛應用的主要因素之一。控制GVHD的發生成為造血干細胞移植中迫切需要解決的問題。以往研究顯示，供體T細胞是誘導GVHD發生最為重要的致病細胞，這種致病性T細胞引起組織損傷，并伴有大量凋亡的發生［1］。本文就是探討在cGVHD患者外周血中CD45RA+與CD45RO+T細胞亞群的特點及其與病情之間的關系。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 64例異基因造血干細胞移植患者均來自2001年3月至2009年9月廣東省人民醫院，其中男43例，女21例，年齡14～58歲，平均(29.6±9.1)歲。所有病例均首次植入成活，獲得造血重建。在64例患者中，未發生cGVHD發生21例，輕度cGVHD 15例，中度 cGVHD 18例，重度 cGVHD 10例。

1.2 方法

1.2.1 移植前預處理方案 改良的白消安/環磷酰胺(Bu/Cy)方案:Bu 1.0 mg/(kg·6 h)，用 3 d;阿糖孢苷(Ara-C)2 g/m2，1 次;Cy 60 mg/kg，2 次，或單次全身照射+環磷酰胺(TBI/Cy)方案以通知線加速器為照射源(單次全身照射700～800 cGy;Cy 1.8 g/m2，2 次)。

1.2.2 移植物抗宿主病(GVHD)預防 HLA相合移植后，給予環胞霉素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)及短程甲氨蝶呤(MTX)方案預防GVHD。HLA配型不合者靜脈滴注兔抗胸腺球蛋白(ATG)，2.5 mg/kg，3～4 d。

1.2.3 cGVHD的診斷和分級標準 cGVHD的診斷主要是根據皮膚改變、口腔黏膜累及程度、肝功指標、四肢關節累及情況以及病理結果進行診斷。根據慢性移植物抗宿主病全球分級標準［2］，綜合考慮患者臨床表現、實驗室檢查結果、放射學特征等因素，人們把有cGVHD特征的患者依照器官受損范圍及程度分為輕、中、重度3級。輕度cGVHD:僅有1～2個器官或部位受損(肺除外)，無明顯功能影響(器官或部位受損為1級);器官或部位受損1級時癥狀相對較輕，如:皮膚改變的面積＜18%且沒有硬化特征，口腔干燥、黏膜輕度萎縮但不影響進食，ALT或AST低于正常上限值的2倍，體重減輕＜5%，關節輕度僵硬但不影響日常生活活動等。中度cGVHD:①至少有1個器官或部位有表現，但大部分功能還存在(器官或部位受損為2級);②3個或更多器官部位受損，但功能沒有完全損失(器官或部位受損為1級)，肺部受損為1級，肺功能檢測指標:1 s用力呼氣容積(FEV1)為60%～79%或肺功能評分(LFS)3～5，走一樓層的階梯就感覺到呼吸困難。重度cGVHD:大部分功能受損，肺部受損為2級。器官或部位受損2級時，癥狀明顯加重，皮膚改變的面積達19%～50%或有表面硬化癥特征，口腔黏膜中度受損并在一定程度上影響進食，丙氨酸轉氨酶或天冬氨酸轉氨酶為正常上限值的2～5倍，體重減輕5%～15%，關節僵硬或攣縮并輕到中度影響日常生活活動，肺功能指標FEV1 40%～59%或LFS 6～9，在平地走路就能感覺到呼吸困難。

1.2.4 試劑和設備(1)鼠FITC-IgG1/PE-IgG1/PE-Cy5.5-IgG1、FITC-CD45/PE-CD14、FITC-CD4、PE-CD45RA、PE-CD45RO、PE-Cy5-CD8 單克隆抗體(monocolonal antibody，McAb)購自 Beckman-Coulter公司。紅細胞裂解液為0.83%氯化銨，洗滌液為含0.5%小牛血清的 PBS，固定液為1%多聚甲醛。(2)主要儀器是美國Becton Dickinson公司的FACSCalibur流式細胞儀。

1.2.5 檢測方法(1)留取移植后(70±3)d患者清晨空腹靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝。(2)抗體組合為:① FITC-IgG1/PE-IgG1/PE-Cy5.5-IgG1;②FITC-CD45/PE-CD14;③FITC-CD4/PE-CD45RA/PE-Cy5-CD8;④FITC-CD4/PE-CD45RO/PE-Cy5-CD8;(3)各檢測管中加入相應組合的熒光素標記的McAb 各 5 μl，再加入混勻的抗凝血 50 μl，混勻，室溫避光孵育20 min。加入溶血素2 ml，混勻，放置5～10 min，待紅細胞裂解。1 000～1 200 r/min離心5 min，棄上清液，懸浮細胞，加入PBS 2 ml，混勻，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清液。懸浮細胞，加入固定液 300 μl，混勻，放置 2℃～8℃ 避光處，24 h內上機分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件包處理，各計量資料用表示。通過兩個獨立樣本t檢驗分析無cGVHD組與cGVHD組間各檢測指標有無差異，如P＜0.05認為差異具有統計學意義;進一步應用單因素方差分析對各組均數做顯著性檢驗，如多組比較有顯著性差異，再采用q檢驗作樣本之間的兩兩比較，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 與未發生cGVHD相比，cGVHD患者外周血中CD4+CD45RA+細胞百分比均明顯降低(P＜0.05)，CD4+CD45RO+細胞百分比均明顯增高(P＜0.05)。CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+細胞百分比均無明顯改變，見表1。

2.2 輕、中、重度cGVHD組分別與未發生cGVHD組比較，CD4+CD45RA+細胞百分比均明顯低于未發生cGVHD組(P＜0.05)，CD4+CD45RO+細胞百分比均明顯高于未發生cGVHD組(P＜0.05)。CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+細胞百分比均無明顯改變。不同程度(輕、中、重度)的cGVHD之間比較，CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+細胞百分比均無明顯改變，見表2。

表1cGVHD組和無cGVHD組外周血CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+檢測結果(%，)Tab.1 Determination results of CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+and CD8+CD45RO+in peripheral blood of non-cGVHD and cGVHD(%，)

表1cGVHD組和無cGVHD組外周血CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+和CD8+CD45RO+檢測結果(%，)Tab.1 Determination results of CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+and CD8+CD45RO+in peripheral blood of non-cGVHD and cGVHD(%，)

Note:Compared with non-cGVHD group，1)P ＜0.05.

Groups n CD4+CD45RA+ CD4+CD45RO+ CD8+CD45RA+ CD8+CD45RO +Non-cGVHD 21 50.29±13.62 68.52±14.71 83.82±82.47±9.20 50.13±15.91 7.93 47.34±12.90 cGVHD 33 37.29±13.471) 82.60±13.701)

表2 輕、中、重度 cGVHD各組和無 cGVHD組外周血 CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+和 CD8+CD45RO+檢測結果(%，)Tab.2 Determination results of CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+and CD8+CD45RO+in peripheral blood of non-cGVHD and cGVHD within different grade(%，)

表2 輕、中、重度 cGVHD各組和無 cGVHD組外周血 CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+和 CD8+CD45RO+檢測結果(%，)Tab.2 Determination results of CD4+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD8+CD45RA+and CD8+CD45RO+in peripheral blood of non-cGVHD and cGVHD within different grade(%，)

Note:Compared with non-cGVHD group，1)P ＜0.05.

Groups n CD4+CD45RA+ CD4+CD45RO+ CD8+CD45RA+ CD8+CD45RO +Non-cGVHD 21 50.29±13.62 68.52±14.71 83.82±80.55±15.82 55.44±8.45 7.93 47.34±12.90 Light cGVHD 15 36.96±12.651) 80.50±10.811) 83.14±10.30 53.10±19.01 Mide cGVHD 18 38.16±14.791) 82.27±6.151) 83.10±15.39 45.87±15.54 Severe cGVHD 10 35.15±13.441) 86.05±11.481)

3 討論

GVHD是allo-HSCT后在受者體內植活的供者淋巴細胞對宿主器官發生的以免疫性損傷為主要特征的免疫性疾病。GVHD的發生率和嚴重程度與主要組織相容性抗原的相合程度，移植物中T淋巴細胞數量的關系最為密切。由于主要組織相容性抗原的復雜性和多態性，絕大多數造血干細胞移植是在不完全相合的情況下進行的，其GVHD的發生率達70%，GVHD的相關死亡率占移植死亡的50%以上［3］。可見GVHD的發生幾率很高，預后也很差。而臨床對于GVHD的診斷仍停留在疾病的發病過程中，沒有一項獨立的實驗室預測指標能有效診斷GVHD的發生。為此，我們對64例異基因造血干細胞移植患者進行回顧性分析，分析無cGVHD組與cGVHD組間CD45RA+和CD45RO+T細胞的變化，以了解 CD45RA+和 CD45RO+T細胞亞群與cGVHD發生之間的關系。

CD45RA和CD45RO是CD45(白細胞共同抗原)的2種異型，均屬Ⅰ型跨膜蛋白，廣泛存在于白細胞表面，其胞漿均具有酪氨酸磷酸酶活性，在淋巴細胞的發育成熟、功能調節及信號傳遞中具有重要意義。根據CD45亞型的表達與否，可以大致將人的T細胞分為初始型T細胞(CD45RA+T細胞)和記憶性T細胞(CD45RO+T細胞)。初始型T細胞與記憶性T細胞的功能有所不同。CD45RA+的初始型T細胞不分泌IFN-γ、IL-4或IL-5，只產生低水平的IL-2，具有抑制免疫的作用［4］。而CD45RO+記憶性T細胞可以分泌IL-2、IL-4或IFN-γ等多種細胞因子，當再一次接觸同一抗原刺激時，其活化閾值更低，有較強的效應功能［5］。有一項免疫缺陷鼠(無脾、淋巴結和黏膜淋巴組織)移植模型研究顯示，只要幾千個同種反應性記憶性T細胞向移植物遷移，就能介導移植排斥反應［6］。

人類身體中存在相當數量的CD45RO+T細胞，即同種反應性記憶性T細胞。這種細胞的產生是由于暴露在同種抗原下，比如妊娠、輸血或早先的器官移植。然而，這種CD45RO+同種反應性記憶性T細胞也存在于從未接觸過外源組織的個體中［7］。此次實驗結果顯示發生cGVHD患者體內的CD4+CD45RO+T細胞明顯高于無 cGVHD患者，提示CD4+CD45RO+T細胞的存在數量與移植后發生cGVHD有密切關系。我們可以推測cGVHD的發生可能是由交叉反應性記憶性T細胞所介導。這類記憶性T細胞可能是早先與病毒或細菌性抗原接觸所產生，能識別同種抗原。它們再次接觸到相同的抗原后，迅速大量活化，產生細胞因子，發生一系列免疫反應，攻擊正常的組織細胞，造成了器官組織功能的損害。但輕、中、重度的 cGVHD之間的CD4+CD45RO+T細胞比較無明顯變化，提示CD4+CD45RO+T細胞與病情的進展無明顯關系。

在本研究中，CD8+亞群并未與CD4+亞群呈現出一致性變化。與對照組比較，發生不同程度的cGVHD患者體內CD8+CD45RO+T細胞均無明顯變化。這可能與標本采集時間有關。在allo-HSCT小鼠模型研究中發現［8］，在GVHD發生過程中有抗原特異性記憶性CD8+T細胞形成，但記憶性CD8+T細胞的數量呈現一定的波動，在移植后14 d達到最高峰，28 d時開始下降。對細胞表面的凋亡相關分子表達分析提示記憶性CD8+T細胞的減少與凋亡的發生有關。以往研究也表明記憶性CD8+T細胞和記憶性CD4+T細胞的產生和維持途徑有所不同［9］，受多種因素制約，還需要進一步的研究。

也有人猜測，患者通過造血干細胞移植后，CD4+CD45RA+T細胞均明顯降低，是因為造血干細胞移植能有效切斷患者CD4+CD45RA+T細胞的供給途經，這種變化有利于患者的長期緩解［10］。但這些理論需要更多的實驗來證實。

綜上所述，本實驗結果表明，異基因造血干細胞移植后，發生cGVHD患者外周血中CD4+CD45RA+T細胞明顯減少，CD4+CD45RO+T細胞明顯增多，CD4+的同種反應性記憶性T細胞可能對cGVHD的發生具有極其深遠的意義。通過檢測CD4+CD45RO+T細胞的百分比，以及CD4+CD45RA+T細胞和CD4+CD45RO+T細胞的比例可以輔助我們判斷cGVHD的發生。

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