HPV感染、HIF-1α及VEGF蛋白表達與非小細胞肺癌相關

周 穎，張 輝，謝永紅，李曉超，沈 彥，尹端端

(秦皇島市第一醫院 1.病理科；2.科教科；3.腫瘤科， 河北 秦皇島 066000)

研究論文

HPV感染、HIF-1α及VEGF蛋白表達與非小細胞肺癌相關

周 穎1*，張 輝1，謝永紅2，李曉超1，沈 彥1，尹端端3

(秦皇島市第一醫院 1.病理科；2.科教科；3.腫瘤科， 河北 秦皇島 066000)

目的探討人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染在非小細胞肺癌(NSCLC)發生中的病因學意義，并初步分析HPV感染與低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達之間的關系。方法用免疫組化法檢測60例NSCLC及20例肺良性病變組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達，用PCR法選用HPV16、18型特異性引物檢測兩組中HPV DNA的表達。結果1)NSCLC組HPV DNA積分吸光度比值為0.6046±0.0224，顯著高于肺良性病變組的0.0275±0.1230(P<0.05)。2)NSCLC組HIF-1α和VEGF蛋白的平均吸光度值分別為0.2548±0.0219和0.2051±0.0321，均顯著高于肺良性病變組(0.0826±0.0150和0.0726±0.0227)(P<0.05)。3)NSCLC中HIF-1α的表達率與VEGF呈正相關(P<0.05)。4) NSCLC中HPV(+)組VEGF的表達率為56.0%，顯著高于HPV(-)組的28.6%(P<0.05)。結論HPV感染可能是NSCLC發生的病因學因素之一；HPV感染可能通過上調VEGF的表達，促進肺癌的發生發展。

非小細胞肺癌；人乳頭狀瘤病毒；低氧誘導因子-1α；血管內皮生長因子

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種DNA病毒，感染人和動物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來，越來越多的國內外臨床和實驗室研究檢測出肺癌患者攜帶HPV[1- 2]，尤其是HPV 16和18型。但HPV感染與肺癌的關系，目前說法不一。低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是近年發現的一種轉錄因子，已有研究發現HIF-1α在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中過度表達。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管形成的中心調控因子，與腫瘤的生長、侵襲、轉移密切相關。然而肺癌中HIF-1α、VEGF與HPV感染的關系尚未見報道。本研究通過檢測非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)中HPV DNA、HIF-1α和VEGF蛋白的表達情況，探討HPV感染在NSCLC發生中的病因學意義，并初步分析NSCLC中HPV感染與HIF-1α、VEGF蛋白表達的關系。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑

收集秦皇島市第一醫院2012- 01—05 SCLC新鮮標本60例， 全部患者均已知情同意，其中男46例，女14例；年齡36～80歲；鱗癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴結轉移30例，無淋巴結轉移30例；吸煙者43例，不吸煙者17例。20例肺良性病變組織，其中包括肺結核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大皰4例，支氣管擴張1例。標本取材后，部分置-20 ℃保存，部分中性甲醛固定，石蠟包埋。

PCR引物均由北京奧科生物公司合成。免疫組化HIF-1α抗體和VEGF抗體及通用型SP試劑盒(福州邁新生物技術開發公司)。

1.2 HPV PCR檢測

1.2.1 引物：選用分別用來擴增HPV16、18型的特異性引物2對及內參GAPDH。引物序列如表1。

1.2.2 組織DNA的提取：取適量凍存組織，加提取緩沖液制成單細胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復抽提3次，再經100%冰冷無水乙醇沉淀、70%冰冷無水乙醇洗滌后，加TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)緩沖液溶解所得DNA，4 ℃保存。

表1 引物序列和產物長度

1.2.3 PCR擴增反應：PCR反應體系：每25 μL反應體系中包含 10×緩沖液 2.5 μL，20 pmol/μL引物各0.5 μL，Taq酶1 μL(1 U/μL)，Mg2+1.5 μL，dNTPs 0.5 μL，去離子水16.5 μL及DNA模板2 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min，循環特征為94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個循環，72 ℃延伸8 min。每次實驗以不加模板為陰性對照，HPV16、18型分別用Siha和HeLa細胞系DNA作陽性對照。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，于紫外透射儀上觀察結果，繼用SQ9636 型掃描系統掃描。HPIAS-1000型圖像分析系統檢測各組目的基因及內參的積分吸光度值(A),并以兩者比值作為各組HPV DNA的相對表達量。

1.3 免疫組化檢測HIF-1α和VEGF

1.3.1 方法：免疫組化染色步驟嚴格按試劑盒說明書操作。一抗稀釋濃度為1/100。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3.2 判斷標準：HIF-1α陽性表達為細胞核出現棕黃或棕褐色顆粒，VEGF陽性表達為胞質出現棕黃或棕褐色顆粒，顯色結果由兩位病理醫生采用半定量評分系統獨立判定。每例均高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，每個視野計數200個細胞，取平均值，用半定量積分法判斷結果：0分陰性；1分<25%；2分25%～75%；3分>75%。陽性強度：1分弱表達(淺黃色)；2分中等強度表達(棕黃色)；3分強表達(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～6分為中等陽性(+)，7～9分為強陽性(++)。就其結果進行分析，將-、±合并為“-”，+、++合并為“+”，以簡化數據處理。同時用HPIAS-1000高清晰度圖像處理系統,分析各組切片的免疫組化結果，用棕黃或棕褐色陽性顆粒的平均吸光度值(A)表示其HIF-1α、VEGF蛋白表達量。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1HPVDNA的PCR檢測結果及與臨床病理特征的關系

M.marker；1,2.HPV16 positive,negative control；3,4.HPV16；5,6.HPV18 positive、negative control；7,8.HPV18圖1 PCR檢測HPV16、HPV18型DNA擴增結果電泳圖Fig 1 Electrophoresis of HPV16/18 DNA detected by PCR

NSCLC組HPV DNA積分吸光度比值為0.6046±0.0224，顯著高于肺良性病變組的0.0275±0.1230(P<0.05)(圖1)；NSCLC組HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關，而與組織分化程度及淋巴結轉移相關。高分化型 HPV DNA積分吸光度比值顯著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴結轉移組HPV DNA積分吸光度比值顯著高于無淋巴結轉移組(P<0.05)(表2)。

表2 NSCLC中HPV感染與臨床病理特征的關系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

圖2 NSCLC中HIF-1α的陽性表達Fig 2 Positive expression of HIF-1α in NSCLC(×400)

2.2 HIF-1α、VEGF的檢測結果及兩者的相關性

NSCLC中HIF-1α的陽性表達位于細胞核(圖2)，平均吸光度值為0.2548±0.0219，顯著高于肺良性病變組的0.0826±0.0150(P<0.05)。VEGF的陽性表達位于胞質(圖3)，平均吸光度值為0.2051±0.0321，顯著高于肺良性病變組的0.0726±0.0227(P<0.05)。NSCLC中HIF-1α(+)組VEGF的表達率為65.5%(19/29例)，明顯高于HIF-1α(-)組的16.1%(5/31例)，經統計學分析，兩者呈正相關(r=0.504,P<0.05)(表3)。

圖3 NSCLC中VEGF的陽性表達Fig 3 Positive expression of VEGF in NSCLC(×400)

HIF?1αnVEGFpositivenegativepositive2919(655%)10(345%)negative315(161%)?26(839%)?

*P<0.05 compared with positive group.

2.3NSCLC中HIF-1α、VEGF蛋白表達與臨床病理特征的關系

HIF-1α表達與性別、年齡、吸煙和組織學分型無關，與組織分化程度及淋巴結轉移相關。高分化型HIF-1α蛋白平均吸光度值顯著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴結轉移組HIF-1α蛋白平均吸光度值顯著高于無淋巴結轉移組(P<0.05)(表4)。VEGF表達與性別、年齡、吸煙和組織學分型無關，與組織分化程度及淋巴結轉移相關。高分化型VEGF蛋白平均吸光度值顯著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴結轉移組VEGF蛋白平均吸光度值顯著高于無淋巴結轉移組(P<0.05)(表5)。

2.4NSCLC中HPV感染與HIF-1α、VEGF表達的關系

NSCLC中HPV(+)組VEGF的表達率為56.0%(14/25例)，顯著高于HPV(-)組的28.6%(10/35例)(P<0.05)。 HPV(+)組與HPV(-)組間HIF-1α的陽性表達率分別為52.0%(13/25例)和45.7%(16/35例)，差異無統計學意義(表6)。HPV(+)、HIF-1α(+)組VEGF的表達率為69.2%(9/13例)，HPV(+)、HIF-1α(-)組VEGF的表達率為41.7% (5/12例)，兩組間無顯著性差異(χ2=1.924,P>0.05)。

表4 NSCLC中HIF-1α表達與臨床病理特征的關系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

表5 NSCLC中VEGF表達與臨床病理特征的關系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

表6 NSCLC中HPV感染與HIF-1α、VEGF表達的關系

*P<0.05 compared with positive group.

3 討論

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來HPV感染與肺癌的關系已經引起人們的重視[3]。本研究證實，NSCLC組HPV DNA表達顯著高于肺良性病變組，提示HPV感染與NSCLC的發生有關，HPV感染可能是NSCLC發生的病因學因素之一。

HIF-1是由α、β亞單位構成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調節。缺氧是實體腫瘤微環境特征之一。細胞缺氧時，細胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調節眾多的下游基因以維持或促進腫瘤的血管形成和腫瘤的發展，而且可反饋接受腫瘤生長過程中產生的因子或缺氧環境上調表達，如此形成惡性循環促進腫瘤生長、侵襲和轉移[4- 6]。本研究中， NSCLC組HIF-1α蛋白表達顯著高于肺良性病變組，提示HIF-1α與NSCLC的發生發展相關。

VEGF是目前已知的作用最強的促血管生成因子，能刺激腫瘤新生血管內皮細胞增殖，促進微小靜脈通透性的增加，誘導血管形成。豐富的腫瘤新生血管必然會加速實體瘤的生長、侵襲及轉移。近年來，肺癌中VEGF表達的研究報道較多，這些研究表明，VEGF在肺癌中高表達，其在肺癌中的表達與肺癌惡性程度、易發生淋巴結轉移及預后不良有關[7]。本研究中， NSCLC組VEGF蛋白表達顯著高于肺良性病變組，提示VEGF參與了NSCLC的發生發展過程。VEGF是HIF-1α最重要的靶基因之一。組織缺氧時，HIF-1α不僅可以促進VEGF轉錄，還能增加VEGFmRNA穩定性，從而上調VEGF表達[8]。大量文獻報道，VEGF和HIF-1α在許多腫瘤中被檢出，并發現HIF-1α升高的同時VEGF表達也上升。本研究顯示NSCLC中HIF-1α(+)組VEGF的表達率顯著高于HIF-1α(-)組，兩者呈正相關。

本研究發現NSCLC中，HPV(+)組VEGF的表達率顯著高于HPV(-)組，提示NSCLC中HPV感染可能上調VEGF表達。HPV(+)組與HPV(-)組間HIF-1α的陽性表達率差異無統計學意義，提示NSCLC中HIF-1α與HPV感染無相關性。本研究還顯示，NSCLC中HPV(+)、HIF-1α(+)組VEGF的表達率與HPV(+)、HIF-1α(-)組VEGF的表達率無顯著性差異。提示HPV感染的NSCLC中，其HIF-1α與VEGF的表達不存在相關性。說明NSCLC中HPV感染上調VEGF表達的這種作用不是通過HIF-1α來調節的，推測可能直接通過HPV16、18 E6蛋白發揮作用，HPV E6可能如一些原癌基因一樣能夠上調VEGF啟動子的活性[9]，促使VEGF表達增強，促進NSCLC發生發展。其具體機制有待進一步在體外細胞培養體系中進行驗證和分析。

NSCLC組中，HPV感染、VEGF表達均與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關，而與組織分化程度相關。可能是由于分化成熟的細胞退出了細胞周期，細胞不再具有分裂能力，細胞內僅有少量病毒復制所需的復制酶。因此，高分化型HPV DNA表達低于中和低分化型，其上調VEGF的作用減弱，使VEGF蛋白的表達也低于中和低分化型。同時發現HPV感染和VEGF表達均與淋巴結轉移有關。推測HPV感染上調VEGF表達，而VEGF是腫瘤發生轉移的一個重要指標，不僅誘導血管生成，還可誘導腫瘤外周形成新的淋巴管，促進癌細胞通過淋巴管轉移到淋巴結。提示HPV感染和VEGF表達在淋巴結轉移中可能起著協同作用。

綜上所述，HPV感染可能是NSCLC發生的病因學因素之一；HPV感染可能通過上調VEGF的表達，促進肺癌發生發展，并參與其浸潤、轉移。 因此選用HPV疫苗預防高危HPV感染及針對VEGF的抗血管治療將為NSCLC的預防和治療開辟新的途徑。

[1] Syrjanen KJ. HPV infection and lung cancer [J]. J Clin Pathol, 2002, 5: 885- 891.

[2] Wang Y, Wang A, Jiang R,etal. Human papillomavirus type 16 and 18 infection is associated with lung cancer patients from the central part of China [J]. Oncol Res, 2008, 20: 333- 339.

[3] Zafer E, Ergun M, Alver G,etal. Detection and typing of human papillomavirus in non-small cell cancer[J]. Respiration, 2004, 71: 88- 90.

[4] 江麗麗, 張建斌, 謝平, 等. LPS預處理增加CoCl2誘導小鼠巨噬細胞表達HIF-1α[J]. 基礎醫學與臨床, 2013, 33: 1297- 1301.

[5] 李能蓮, 李光明, 駱亞莉, 等.HIF-1α和HIF-2α在胃癌中的表達及意義[J]. 基礎醫學與臨床, 2010, 30: 619- 622.

[6]王路喬, 黃波, 黃茶花, 等. 自噬抑制劑促進缺氧誘導的大鼠乳鼠心肌細胞凋亡[J]. 基礎醫學與臨床, 2014, 34: 185- 189.

[7] 楊東霞, 項鋒鋼. 肺癌患者血管內皮生長因子表達與缺氧及腫瘤生物學行為和預后的關系[J]. 中國臨床康復, 2005, 9: 115- 118.

[8] 楊清平, 周知, 呂波, 等. 小劑量VCR聯合Endostar抑制PLA-802細胞系VEGF表達[J]基礎醫學與臨床, 2011, 31: 32- 36.

[9] Lopez-ocejo O, Viloria-petit A, Bequet-romero M,etal. Oncogenes and tumor angiogenesis:the HPV-16 E6 oncoprotein activates the vascular endothelial growth factor(VEGF) gene promoter in a p53 independent manner[J]. Oncogene, 2000, 19: 4611- 4620.

Infection of HPV and its relationship withthe expression of HIF-1α and VEGF protein in non-small cell lung cancer

ZHOU Ying1*, ZHANG Hui1, XIE Yong-hong2, LI Xiao-chao1, SHEN Yan1, YIN Duan-duan3

(1.Dept. of Pathology; 2.Dept. of Science and Education;3.Dept. of Oncology, the First Hospital of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066000, China)

ObjectiveTo investigate the etiological role of human papillomavirus(HPV) infection in the carcinogenesis of non-small cell lung cancer(NSCLC) and to discuss the possible relationship between HPV infection and HIF-1α,VEGF expression.MethodsBy using immunohistochemistry, the expressions of HIF-1α and VEGF protein were detected in 60 cases of NSCLC tissues and 20 cases of lung benign diseases tissues. PCR was employed to detect the expression of HPV16/18 DNA.Results1)The HPV DNA expression was 0.6046±0.0224 in NSCLC group which significantly higher than 0.0275±0.1230 in the benign diseases group (P<0.05). 2)The HIF-1α protein and VEGF protein expressions were 0.2548±0.0219 and 0.2051±0.0321 respectively in NSCLC, significantly higher than that in the benign diseases group (0.0826±0.0150 and 0.0726±0.0227) (P<0.05). 3)The expression rate of HIF-1α was significantly correlated with VEGF in NSCLC(P<0.05).4)The positive expression rate of VEGF was significantly higher in HPV DNA positive group (56.0%) than that in HPV DNA negative group(28.6%,P<0.05) in NSCLC.ConclusionsHPV infection may be one of the etiological factors in the carcinogenesis of NSCLC. HPV infection increases VEGF expression, promotes the occurrence and development of NSCLC.

non-small cell lung cancer; human papillomavirus; hypoxia inducible factor-1α; vascular endothelial growth factor

2014- 01- 09

2014- 03- 24

秦皇島市科技支撐計劃(2012023A135)

*通信作者(correspondingauthor)：zhouying8042254@sina.com

1001-6325(2014)08-1065-06

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聽力受損與老年人智力衰退有關

據美國WebMD醫學新聞網2013-02-04報道，聽力受損和智力衰退是兩種常見的老化癥狀，現有研究發現，兩者之間可能有關聯。

70歲以上的老年人中，約有2/3有一定程度的聽力受損。在未來20年，患老年癡呆癥的人數預計將增加1倍，所以研究人員希望了解助聽器是否可以減緩老年人智力衰退。

領導這項研究的耳科醫生、流行病學家Frank R. Lin博士認為，在研究過程中，聽力衰退的年長者比聽力正常者更容易有記憶和思考問題。平均來說，有聽力問題的參與者智力明顯受損的時間，比那些沒有聽力問題的人提前3年。

這項針對近2 000名參加老化與健康研究的70～80歲年長者，在第5年做了聽力測試，并在接下來6年里進行了一系列的測試，評估記憶和思考能力的衰退情況。結果顯示，聽力受損的男、女衰退速度比聽力正常者快30%～40%；聽力受損的程度越大，心智功能衰退幅度越大。

雖然研究并未提出與老化有關的聽力受損是如何惡化記憶或思考問題，但Lin博士認為，有幾種說法：一種理論是未治療聽力受損的人，常與社會隔離，導致智力下降。之前的研究已鑒定出，孤獨是這些能力衰退的風險因子。另一個理論是，工作記憶受限于它可以容納和操作的信息量。內耳的工作是接收聲音，并在傳到大腦譯碼之前準確的編碼，但這對于有聽力受損的人很難。如果大腦必須不斷消耗更多的資源來解碼聲音，可能為認知付出更多。

研究結果發表在美國醫學協會(JAMA)內科期刊(JAMA Internal Medicine)網絡版。