禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗抗原國家參考品的研制

胡井雷，劉景利，楊 帆，徐姍姍，張從祿，劉光磊，田國彬，孫建宏*

(1.哈爾濱維科生物技術開發公司，哈爾濱150069;2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，哈爾濱150001)

國家生物參考品系指用國際參考品標定的，或我國自行研制的(尚無國際參考品者)用于微生物(或其產物)的定性鑒定或疾病診斷的生物試劑、生物材料或特異性抗血清;或指用于定量檢測某些制品的生物效價的參考物質，其效價以特定活性單位表示，不以IU表示。它的某些理化性質已經準確測定，主要用于校準儀器、評價測量方法和確定材料或產品的特性量值，在量值傳遞和保證測量一致性方面起著重要作用。禽流感病毒 (H5亞型)血凝抑制試驗抗原國家參考品用于檢測禽流感病毒(H5亞型)制品生物效價和血液凝集試驗以及血凝抑制試驗操作過程中的校驗，目前尚無國際標準品。在檢驗工作中除應采用平行樣、空白試驗、標準曲線等減少誤差的方法外，更應廣泛使用標準物質來對試驗的過程中進行檢驗，因此在檢驗工作中，特別是在某些特殊條件下，需要把標準物質或參考品和樣品同時進行檢測，通過測得標準物質或參考品的含量和實際含量間的差來檢驗檢測數據的準確度。

禽流感病毒 (H5亞型)血凝抑制試驗抗原國家參考品的研制就是為了更加準確的進行免疫監測及對疫苗免疫效果進行正確評價，對于檢測血清中的抗體水平的準確性的提高具有較大的推進作用。研究依據國家一級標準物質的要求［1］和禽流感病毒(H5亞型)血凝抑制試驗抗原制造及檢驗規程［2］(以下簡稱規程)以及相關國家標準中對國家參考品的要求。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗采用的病毒為規程規定的標準毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株，由國家禽流感參考實驗室鑒定、保管和供應。SPF雞胚由哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 禽流感病毒(H5亞型)抗原標準品的制備

將禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株按照規程的規定，用生理鹽水作10－5稀釋，然后接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，劑量為0.1 mL/胚，接種后置于37℃孵化箱孵化，將24 h前死亡雞胚棄去，24 h后死亡的雞胚隨時取出，至72 h，將全部雞胚取出置于2～8℃冷卻，無菌收獲雞胚尿囊液。將收獲的雞胚尿囊液經滅活、無菌檢驗、效價測定后，添加保護劑，保護劑參照《中華人民共和國獸用生物制品規程》(二○○○年版)規定的配方和配制方法制備。然后按照每瓶1 mL進行精確分裝后凍干，抗原批號為201001。

1.2.2 物理性狀、剩余水分及真空度測定 按規定方法［4］進行，應符合要求。

1.2.3 無菌檢驗 按規定的無菌檢驗方法［4］進行抽樣檢驗。

1.2.4 特異性試驗 按規定HI試驗的方法［4］，采用制備的抗原分別對H5亞型、H7亞型和H9亞型禽流感病毒陽性血清、雞新城疫陽性血清、減蛋綜合征陽性血清進行HI試驗，鑒定其對H5亞型反應的特異性。

1.2.5 抗原效價的定值 按照國家一級標準物質要求由8家具有資質且事先經過比對確認其定值能力相同的試驗室，采用紅細胞凝集試驗96孔微量板法進行標定。按照《禽流感H5亞型血凝抑制抗原國家參考品協作標定操作規范》進行操作。對被測參考樣品分別做6次獨立的測定，分2個單元，每個單元做3次獨立測定;2個單元之間相隔不少于3 d。所獲得的6個數據用描述性統計方法檢驗異常值，如發現有異常值，應予標明，并補做1次測定。最后報出全部結果。匯總全部原始數據，采用描述性統計方法進行分析，剔除異常值，確定適宜范圍及眾數。

1.2.6 均一性檢驗 按照國家一級標準物質要求隨機抽取樣品15支，用電子分析天平分別稱量每支內容物的凈重量，用統計學方法分析其均一性。按照國家一級標準物質要求被檢組數據差異應不顯著，變異系數在5%以內。

1.2.7 穩定性檢驗 按照國家一級標準物質要求，抗原在－20℃、4℃、37℃條件下保存，并定期進行HA價測定，每一時間均要進行2次重復測量，用統計學方法從統計上剔除可疑值，再計算每次的平均值，該值與定值的偏差應不大于標準偏差。

2 結果

2.1 禽流感病毒 HI抗原標準品物理性狀檢驗HI抗原凍干制品均為灰白色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后能迅速溶解。

2.2 無菌檢驗 HI抗原凍干制品無菌檢驗結果均符合規定。

2.3 剩余水分測定 四次剩余水分含量測定結果分別為 2.12%、2.07%、1.94% 和 1.32%，均小于3%，符合標準物質的要求。

2.4 真空度測定 所有安瓶真空度均呈紫色輝光，均符合要求。

2.5 特異性試驗 抗原特異性檢驗結果顯示，201001抗原只能被H5亞型陽性血清所抑制，而對H7、H9、新城疫陽性血清、雞減蛋綜合征陽性血清均呈陰性反應。

2.6 抗原效價的定值 協作標定結果見表1。經描述性統計學分析，該批抗原血凝價為1∶(160±80)，由于數據是非連續的，剔除少量異常值，適合看眾數。眾數是1∶80，因此將HA效價定值為1∶80，即 80 HAU/支。

表1 抗原效價協作標定結果

2.7 均一性檢驗 樣品重量在0.1164～0.1260 g之間。描述性生物統計分析得出:樣品重量平均數為0.1208 g變異系數(CV)為4.3%，被檢組數據經生物統計學結果分析為差異不顯著表明該批參考品裝量均一。

2.8 穩定性檢驗 該抗原在37℃條件下保存35天HA價未下降，42 d略有降低，結果見表2。4℃保存6個月和－20℃保存24個月時HA價未下降，在統計學上亦無差異，說明該批制品穩定性良好。

表2 37℃保存的穩定性檢驗結果

3 討論

H5亞型在禽流感病毒中具有重要的地位，本實驗室在研制出禽流感病毒(H9亞型)血凝抑制試驗抗原國家參考品后［5］，依據國家一級標準物質的要求和禽流感病毒(H5亞型)血凝抑制試驗抗原制造及檢驗規程中的規定，結合了相關國家標準研制出禽流感病毒(H5N1亞型)血凝抑制試驗抗原國家參考品。該參考品經全面檢測后完全符合國家參考品的各項指標要求。

根據國家一級標準物質的要求本項實驗研制的禽流感抗原國家參考品的定值只能由多家具有資質和HI檢測能力的實驗室進行協作標定確定，綜合考慮實驗室的水平、地域分布等因素，我們在國內選擇了8家HI檢測水平較高的實驗室進行了統一的協作標定，目的就是對國家參考品進行精確定值。由于標準物質是需要一個相對較長的保存過程，所以在保存期試驗中，我們也將會對在－70℃條件下保存的標準物質每年定期進行測定。

［1］ 國家標準物質中心.一級標準物質技術規范(JJClf)06－94)［S］.1994.

［2］ 中華人民共和國農業部.禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗抗原與陰、陽性血清制造及檢驗試行規程［S］.2006.

［3］ 中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生物制品規程二○○○年版［S］.

［4］ 中華人民共和國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版［S］.

［5］ 孫建宏，劉景利，胡井雷，等.禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原國家參考品的研制［J］.中國獸藥雜志，2013，47(4):17－19.