氣相色譜法檢測沙咪珠利中的殘留溶劑

王昊欣，王霄旸，張麗芳，鄭文麗，費陳忠，張可煜，王 米，李 濤，王春梅，肖 遂，薛飛群

(中國農業科學院上海獸醫研究所，中國農業科學院獸藥安全評價與殘留研究重點開放實驗室，農業部動物寄生蟲學重點開放實驗室動物藥學研究室，上海200241)

球蟲病是危害養禽業的重大原蟲病，目前球蟲病的防治主要依賴于三嗪類、磺胺類等抗球蟲藥物［1］。然而，當前臨床上球蟲耐藥性普遍，防治效果越來越低下，亟需安全、高效、無交叉耐藥的新型抗球蟲藥物以應對這一局面［2－3］。沙咪珠利是一種新型三嗪類抗球蟲藥，是由中國農業科學院上海獸醫研究所動物藥學研究室自主研發的新型抗球蟲化合物。已有研究結果顯示沙咪珠利不僅具有良好的抗球蟲效果(抗球蟲指數 ACI達185～200)，且無致畸、致癌、致突變作用，具有良好的應用前景，可能成為一種新型抗球蟲藥物。依據《中華人民共和國獸藥典》規定，殘留溶劑檢測須對合成工藝中使用的全部第二類溶劑和終產品精制過程中使用的第三類溶劑進行研究。在合成沙咪珠利的工藝中，使用了第二類溶劑甲醇和甲苯;精制時使用了第三類溶劑乙醇，因此本文建立了這三種有機溶劑的氣相色譜法檢測其殘留含量［4－5］。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 7890A氣相色譜儀，帶FID檢測器(美國Agilent公司);DB－WAX(30 m×0.25 mm × 0.25 μm)色譜柱(美國 Agilent公司);Mettler Toledo XP504分析天平(梅特勒－托利多公司);甲醇、乙醇、甲苯、二氧六環和N，N－二甲基甲酰胺均為分析純。

1.2 標準品和樣品 沙咪珠利對照品(批號:20130429)及原料藥(批號:20130304、20130308、20130411)為本實驗室合成。

1.3 溶液配制

1.3.1 內標溶液 精密稱量154.9 mg二氧六環，置于50 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.2 供試品溶液 精密稱取沙咪珠利原料藥0.1 g，加入1 mL內標溶液，置于10 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.3 對照品溶液 精密稱量31.68 mg甲醇，47.4 mg乙醇，8.67 mg甲苯，置于50 mL 容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻;精密量取該溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加1 mL內標溶液，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。其中甲醇、乙醇和甲苯的含量分別為 316.8、474 和 86.7 μg/mL。

1.4 檢測方法

1.4.1 色譜條件 DB－WAX(30 m ×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱;進樣口溫度180℃，分流比50:1;程序升溫，初始柱溫60℃，保持4 min，50℃/min升至80℃，保持1 min，再以100℃/min升至200℃，保持4 min;載氣為氮氣，柱流速1.0 mL/min;檢測器為FID，檢測器溫度200℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速 300 mL/min;進樣量 1.0 μL。

1.4.2 測定方法 精密量取供試品溶液1.0 μL，按照上述氣相色譜法采用溶液直接進樣，記錄色譜圖，計算各待測物與內標物的峰面積比，以標準曲線定量測定。甲醇含量不得超過0.3%，乙醇的含量不得超過 0.5%，甲苯的含量不得超過0.089%［5］。

1.5 方法學驗證

1.5.1 系統適用性試驗 根據《中華人民共和國獸藥典》殘留溶劑測定要求，進行系統適用性試驗［5］。取 N，N －二甲基甲酰胺溶劑進樣 1.0 μL，記錄色譜圖(圖1)，由圖1可見，空白溶劑在各待測物的出峰處沒有干擾;取對照品溶液，按照1.4.2項中測定方法連續進樣5次，記錄色譜圖(圖2)。以各待測物與內標物的色譜峰計算，試驗所用毛細管色譜柱理論塔板數大于5000;色譜圖中，各待測物與相鄰色譜峰分離度大于1.5;對照品溶液連續進樣5次，所得各待測物與內標物峰面積之比的RSD值均小于5%，系統適用性試驗結果見表1和表2。

圖1 溶劑N，N-二甲基甲酰胺的色譜圖

圖2 甲醇、乙醇、甲苯和二氧六環(內標)的色譜圖

表1 系統適用性結果

表2 進樣重現性結果

1.5.2 精密度

1.5.2.1 重復性 取對照品溶液，按照 1.4.2 項中色譜條件連續進樣6針，記錄色譜圖，以內標法計算各待測物的含量，計算RSD值，結果顯示均小于2%(表3)。

表3 重復性測定結果

1.5.2.2 日間精密度 取對照品溶液，按照 1.4.2項中色譜條件，分別由不同的三人于第1、2、3天分別進樣，記錄色譜圖，以內標法計算各待測物的RSD值，結果顯示均小于5%(表4)。

表4 日間精密度試驗結果

1.5.3 線性范圍 精密取甲醇、乙醇和甲苯適量，置于10 mL容量瓶中加1 mL內標溶液，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，分別配制成一系列不同質量濃度的甲醇、乙醇、甲苯和內標的混合溶液，按照1.4.2項中色譜條件進樣，記錄色譜圖。以各待測物濃度(μg/mL)為橫坐標，以各待測物與內標物的峰面積比為縱坐標，建立回歸方程，甲醇、乙醇和甲苯的回歸方程分別如表5所示。結果顯示，各待測物R2＞0.99，線性關系良好。

表5 線性及范圍結果

1.5.4 檢測限及定量限 取各待測物線性最低濃度溶液，逐級稀釋，按照1.4.2項中色譜方法進樣。當信噪比為3時，將該待測物在沙咪珠利樣品濃度記為檢測限;同理，信噪比為10時，記為定量限。各待測物測定結果如表6所示。

表6 檢測限與定量限結果

1.5.5 回收率 對沙咪珠利樣品殘留溶劑水平進行初步測定，測得乙醇濃度約為25 μg/kg。精密量取 31.68 mg甲醇、47.4 mg 乙醇、8.67 mg 甲苯，置于100 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻;精密量取該溶液 0.4、0.5、0.6 mL 各3份，分別置于9個10 mL容量瓶中，各加1 mL內標溶液;取9份沙咪珠利原料藥(批號:20130308)0.1 g，精確稱重，分別置于上述9個10 mL容量瓶，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，即得。此時乙醇濃度分別為 18.96、23.7、28.44 μg/kg。選取乙醇濃度23.7 μg/kg作為回收率100%標準，按照1.4.2項中色譜方法進樣。結果顯示，各次測定回收率均為95% ～105%，且RSD＜5%。甲醇、乙醇、甲苯的回收率測定結果分別見表7、表8、表9。

表7 甲醇回收率測定結果

表8 乙醇回收率測定結果

表9 甲苯回收率測定結果

2 樣品殘留溶劑檢測結果

取20130304、20130308、20130411 批次沙咪珠利原料藥，按照1.3.3項中方法配制供試品溶液，按照1.4.2項中色譜條件進樣，記錄色譜圖。經測定，各批次沙咪珠利樣品中均未檢出甲醇和甲苯，檢出乙醇(圖3)。沙咪珠利樣品中乙醇測定結果如表10所示。

表10 乙醇殘留溶劑檢測結果

圖3 沙咪珠利樣品的色譜圖

3 討論

實驗結果表明，沙咪珠利樣品中未檢出甲醇和甲苯，檢出乙醇殘留，其中每0.1 g沙咪珠利樣品中含有乙醇濃度為 18.41 ～ 22.34 μg/mL，在樣品中占百分比為0.184% ～0.223%，低于藥典規定限度0.5%［5］。因此沙咪珠利原料藥中的溶劑殘留符合獸藥典規定。

在選擇色譜條件時，曾選用過弱極性的HP－5和DB－35ms毛細管柱。但由于甲醇和乙醇極性相近，二者在HP－5和DB－35ms色譜柱上無法實現基線分離，而使用極性較強的DB－WAX色譜柱后，可以滿足色譜分離度要求。

由于研究中采用N，N－二甲基甲酰胺作為溶劑，其沸點較高，為152.8℃，因此進樣口溫度設定為180℃，目的在于使高沸點的N，N－二甲基甲酰胺溶劑能夠在進樣口瞬間全部蒸發;采用程序升溫使得色譜柱在短時間內迅速升溫至200℃，目的在于使N，N－二甲基甲酰胺的出峰時間提前，縮短分析時間。

本研究建立了測定沙咪珠利中甲醇、乙醇和甲苯溶劑殘留的氣相色譜方法。研究表明，本方法簡單、精密度高、重現性好及檢測限低。采用本方法能夠很好的評價沙咪珠利合成工藝的殘留溶劑水平。

［1］ 索 勛，李國清.雞球蟲病學［M］.北京:中國農業大學出版社，1998:166－167.

［2］ 韓春來，王麗明，鄭明學，等.雞球蟲的耐藥性研究進展［J］.畜禽業，2001，(4):32 －33.

［3］ 李佩國.河北省雞柔嫩艾美耳球蟲地方株的耐藥性檢測［D］.長春:吉林大學，2010.

［4］ 胡昌勤，劉 穎.藥物殘留溶劑的監控及其分析方法［J］.藥學學報，2007，42(12):1237－1242.

［5］ 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版一部(附錄81)［S］.