超高效液相色譜－串聯質譜法研究克倫特羅在絨山羊體內消除規律

王麗娜，劉 凱，李延山，杜柏林，張 明

(遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，沈陽110016)

克倫特羅添加到飼料中，能有效地促進畜禽蛋白質合成和肌肉組織生長，減少皮下脂肪的沉積，提高瘦肉率和飼料轉化率［1］，在畜禽養殖中具有可觀的經濟效益。由于利益的驅動，在畜牧養殖環節出現了以克倫特羅為代表的β－受體激動劑(俗稱“瘦肉精”)的濫用，導致其在動物體內蓄積殘留，消費者購買帶有藥物殘留的畜禽產品就會引起急性中毒［2］。近年來，國內外發生了多起由于食用了瘦肉精飼喂的動物產品而導致的中毒事件，中毒事件的不斷發生使得各國相繼出臺禁令。農業部于1997年3月［農牧發(1997)］3號文嚴令禁止克倫特羅等β－激動劑在動物生產中的應用。目前有文獻［1］報道豬體內克倫特羅的殘留消除規律，尚未見克倫特羅在絨山羊體內消除規律研究的報道。本研究建立了檢測絨山羊尿液、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉中克倫特羅的UPLC－MS/MS方法，并對克倫特羅在絨山羊體內的消除規律進行了系統研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集 參照文獻［3－5］報道，選取體重約為(30±4.8)kg絨山羊60只，隨機分為2組(A、B組)，每組30只。常規飼養，自由飲水，飼料為配合日糧。A組給藥濃度為150 μg/kg b.w.，B 組給藥濃度為300 μg/kg b.w.。連續給藥25 d后停藥。停藥后第1天、第3天、第5天、第7天、第10天、第15天 、第20天、第25天、第30天、第40天每組每個測試時間點隨機取3只宰殺，每只動物取上述4種組織樣品(肝臟、肺、腎臟、肌肉)。每組隨機取8只絨山羊，每天對其尿液進行監測。

1.2 儀器與材料 液相色譜－串聯質譜儀:Waters Quattro premierXE;高速冷凍離心機(Biofuge STRATOS Centrifuge);均質器(PRO250);氮吹儀(OASYS);MilliQ超純水器(美國Millipore公司);甲醇、甲酸、氨水、高氯酸、MCX固相萃取小柱。

1.3 儀器條件 根據文獻［6－7］方法，儀器條件如下。色譜柱:BEH C18(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)。流動相A:甲醇;B:0.1%甲酸水溶液;流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序，0～5.0 min，4%A 線性變化至 60%，5.0 ～5.1 min，60%A 線性變化至40%A，5.1～6.0 min維持4%A。柱溫40 ℃，進樣量10 μL。

電噴霧正離子掃描(ESI+);監測方式:多反應監測(MRM);電壓3.2 kV;源溫120℃;霧化氣溫度350℃;錐孔氣流速50 L/h;霧化氣流速650 L/h;定性定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 克倫特羅及其內標定性、定量離子對及碰撞電壓、錐孔電壓表

1.4 溶液的配制

1.4.1 標準溶液的配制 精密稱取克倫特羅對照品，以甲醇為溶劑配成濃度各約1 mg/mL標準儲備液，2～8℃冷藏保存。準確吸取適量上述標準儲備液，用0.2%甲酸水溶液稀釋成濃度為10 μg/L對照品標準工作液。

1.4.2 內標溶液配制 精密稱取克倫特羅－D9同位素內標，以甲醇為溶劑配成濃度約為10 mg/mL的同位素內標儲備液。取同位素內標儲備液，用0.2%甲酸水溶液稀釋成濃度為40 μg/L對照品標準液，2～8℃冷藏保存，有效期1個月。

1.5 樣品的提取與凈化［3］

1.5.1 提取 取尿液5.0 mL(組織2.00 g)于50 mL離心管中，添加內標工作液100 μL，充分混勻。加入40 μL β－葡萄糖醛酸－芳基硫酸酯酶，15 mL 0.2 mol/L 醋酸銨緩沖溶液(pH 5.2)，37.0 ℃震蕩水浴16 h，加入0.5 mL高氯酸，渦旋混勻，10000 r/min離心5 min。

1.5.2 凈化 固相萃取小柱用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 2%甲酸水溶液活化，將上述提取液全部過柱，3 mL 2%甲酸水溶液，3 mL甲醇淋洗。空氣抽干。5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，40℃氮氣吹干后，1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，經 0.22 μm 水系微孔濾膜過濾后，供UPLC－MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 分析條件的優化 β－受體激動劑在C18柱上的保留性較好，本研究比較了幾種類型的C18色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm、ACQUITY UPLC HSS C18、ACQUITY UPLC HSS T3 柱的分析結果，結果顯示，ACQUITY UPLC BEH C18上的保留時間及分離度均比較理想，因此選擇該柱為分析柱。先后采用乙腈和水、甲醇和0.1%甲酸溶液［6］、乙腈和0.1%甲酸溶液［7］、甲醇和水、甲醇和5 mmol/L乙酸銨幾種流動相進行分析，結果顯示流動相為甲醇和0.1%甲酸溶液時靈敏度最高、重復性最好。因此選擇甲醇和0.1%甲酸溶液為流動相。

用500 μg/L的激動劑標準溶液以流動注射的方式分別用ESI+和ESI－模式進行全掃描，發現克倫特羅在ESI+電離模式下響應值大大高于ESI－模式下的響應值，因此采用ESI+電離模式。對毛細管電壓進行優化，結果在3.2 kV響應值最大，對母離子產生的子離子及碰撞能量進行優化，從中選出豐度較高的子離子作為定性和定量離子。

2.2 方法學考察

2.2.1 方法專屬性考察 對照品溶液色譜圖見圖1。取空白樣品，按1.5項操作，得圖2～圖6。在上述條件下，樣品雜質無干擾，專屬性良好。

2.2.2 線性范圍、檢出限、定量限 配置標準曲線，濃度分別為 0.5、1、5、10、25、50、100 μg/L，以待測物濃度為橫坐標(X，μg/L)，以標準溶液中被測組分峰與內標面積的比值為縱坐標(Y)，進行回歸運算。Y=1.168X+1.346，r2=0.998(n=2)。當添加0.1 μg/L 克倫特羅時，信/噪(S/N)比大于3，檢測限為0.1 μg/L。取空白樣品制備添加濃度0.2 μg/L 樣品(n=6)，信/噪(S/N)比均大于 10，因此定量限為 0.2 μg/L(圖7、圖8)。

2.2.3 方法的精密度 按1.5項操作，制備低、中、高三個濃度水平，分別為 0.2、0.4、2(尿液為μg/L，其他組織為μg/kg)的質量控制(QC)樣品，每一濃度進行6樣本分析，根據當日的標準曲線，進行樣品的濃度測定。結果表明，精密度在2.5%～18.9%(表2)之間。

2.2.4 回收率試驗 按1.5項操作，制備低、中、高三個濃度水平，分別為0.2、0.4、2(尿液為 μg/L，其他組織為μg/kg)的質量控制(QC)樣品，每一濃度進行6樣本分析，根據當日的標準曲線，進行樣品的濃度測定。結果表明，回收率在87.5% ～116.1%(表2)之間。

表2 尿液與組織添加回收率結果(n=6)

2.3 消除規律研究

2.3.1 絨山羊給藥階段鹽酸克倫特羅在尿液中消除規律 A組給藥后24 h內能在尿液中檢測到克倫特羅，而且濃度高達289 ng/mL。隨著給藥次數的增加，通過尿液排出的克倫特羅含量持續升高，直到給藥后第11天，達到第一次峰值，為5313 ng/mL，隨后尿液中克倫特羅濃度呈較平穩的變化趨勢，直到給藥后第22天，尿液中克倫特羅濃度達到第二次峰值，為3825 ng/mL。B組給藥后24 h內在尿液中檢測到克倫特羅，濃度高達1323 ng/mL，直到給藥后第9天，尿液中克倫特羅濃度達到第一次峰值，為11378 ng/mL，隨后尿液中克倫特羅濃度呈較平穩的變化趨勢，直到給藥后第23天，尿液中克倫特羅濃度達到第二次峰值，為6890 ng/mL。A、B兩組代謝規律見圖9(n=8，RSD≤48.7%)，數據濃度偏差較大可能是由于絨山羊個體差異以及飼喂方式導致。

2.3.2 絨山羊停藥階段鹽酸克倫特羅在尿液中消除規律 停藥后尿液中殘留的克倫特羅濃度持續降低，降至第40天后A組尿液殘留濃度約9 μg/L，B組尿液殘留濃度約6 μg/L。出現A組尿液中部分克倫特羅殘留濃度大于B組，以及數據濃度偏差較大，可能是由于絨山羊個體差異以及飼喂方式導致。殘留趨勢線見圖10(n=3，RSD≤54.3%)。

圖9 飼喂階段羊尿液中克倫特羅含量(n=8)

圖10 停藥階段羊尿液中克倫特羅含量(n=3)

2.3.3 絨山羊停藥后鹽酸克倫特羅在組織中消除規律 停藥后第1天、第3天、第5天、第7天 、第10天、第15天 、第20天、第25天、第30天、第40天每組每個測試時間點隨機取3只宰殺，每只動物取上述4種組織樣品(肝臟、肺臟、腎臟、肌肉)。各組織殘留數據見表3。

表3 絨山羊停藥階段各組織中鹽酸克倫特羅殘留濃度

結果表明絨山羊肝臟、肌肉、肺臟、腎臟中均能檢測到克倫特羅殘留。不同組織中克倫特羅殘留濃度不同。停藥1 d，各組織中殘留濃度依次為肝臟＞腎臟＞肺臟＞肌肉。由于克倫特羅在不同的組織中消除速率不同，停藥第15天后，A組肝臟濃度下降了約8倍，腎臟濃度下降了約68倍，肺臟濃度下降了約26倍，肌肉濃度下降了約16倍;B組肝臟濃度下降了約12倍，腎臟濃度下降了約108倍，肺臟濃度下降了約41倍，肌肉濃度下降了約15倍，從而得出各組織消除速率為腎臟＞肺臟＞肌肉＞肝臟。克倫特羅在羊肝臟中消除最慢，在腎臟中消除最快。

3 結論

本試驗建立了專屬、靈敏的UPLC－MS/MS檢測方法，并研究了克倫特羅在絨山羊尿液及各組織中的消除規律。結果顯示，絨山羊的尿液、肝臟、肌肉、肺臟、腎臟中均能檢測到克倫特羅殘留，并在停藥后需較長時間消除。停藥后尿液中殘留的克倫特羅濃度持續降低，降至第40天后A組尿液殘留濃度約9 μg/L，B組尿液殘留濃度約6 μg/L。出現A組尿液中部分克倫特羅殘留濃度大于B組，可能是由于絨山羊個體差異以及飼喂方式導致。停藥40 d后，A、B兩組肝臟、腎臟均能檢測到克倫特羅殘留，肺臟和肌肉未檢出。

［1］ 方炳虎，陳杖榴，黃顯會.克倫特羅在豬體內的生物利用度及藥物動力學研究［J］.畜牧獸醫學報，1997，28(3):233 －237.

［2］ 張園園，吳永寧.克倫特羅的毒性作用及其中毒機制［J］.衛生研究，2002，31(4):328－330.

［3］ 楊 靜.肉羊組織中鹽酸克倫特羅檢測方法及代謝殘留規律的研究［D］.北京:中國農業科學院，2011.

［4］ 呂 燕，鮑偉華，余小華，等.GC－MS法研究豬體內克侖特羅的殘留消除規律［J］.中國獸藥雜志，2009，43(11):26 －29.

［5］ 吳澤君，龍凌云，郭世明.高效液相色譜－串聯質譜法研究豬毛發中克侖特羅和萊克多巴胺的殘留及代謝規律［J］.中國獸藥雜志，2010，44(8):22 －26.

［6］ 農業部1063號公告－3－2008.動物尿液中11種β—受體激動劑的檢測 液相色譜－串聯質譜法［S］.

［7］ 農業部1025號公告－18－2008.動物源性食品中β－受體激動劑殘留檢測液相色譜－串聯質譜法［S］.