共表達siat7e和st3galⅠ基因MDCK細胞株的建立

張啟龍，陳小云，王 棟

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

采用哺乳動物細胞系生產流感疫苗工藝因具有無外源因子污染、純度高、安全性好［1］等特性，逐漸替代了傳統的雞胚生產工藝。其中MDCK細胞具有易培養、增殖快、流感病毒易感等特點，被作為流感病毒疫苗生產的重要細胞系之一［2］。

研究［3］發現，siat7e(ST6GALNacⅤ)是控制細胞貼壁程度的重要基因之一，其編碼的蛋白屬于α－2，6唾液酸轉移酶家族成員，該基因表達水平的增加將降低細胞貼壁程度。St3galⅠ(beta－galactoside alpha－2，3－sialyltransferase I)基因編碼β－半乳糖苷α－2，3唾液酸轉移酶I，可催化唾液酸與半乳糖以α－2，3連接形式［4］構成流感受體組分，提高宿主細胞對流感病毒的敏感性。本文擬構建共表達siat7e和st3galⅠ基因的MDCK細胞株，以圖同步解決MDCK細胞的懸浮培養及提高流感病毒敏感性。

1 材料與方法

1.1 細胞與載體 MDCK細胞來自國家獸醫微生物菌種保藏中心;Top 10感受態細胞購自天根生化科技(北京)有限公司;pMD18－T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;攜帶eGFP和siat7e、st3galⅠ基因的真核表達載體 pReceiver－siat7e－st3galⅠ［5］及pCMV－GFP載體，本室構建保存。

1.2 主要試劑 細胞/細菌總RNA提取試劑盒(DP430)、質粒小提試劑盒為天根(北京)生化科技有限公司產品;Taq DNA聚合酶、DL－2000 DNA分子量標準、Premix Ex TaqTM等為寶生物(大連)有限公司產品;氨芐青霉素、瓊脂糖凝膠為Sigma公司產 品;Lipofectamine?2000 Transfection Reagent、DMEM、G418為 Invitrogen公司產品;DIG Glyan Differentiation Kit、Anti－ digoxigenin － rhodamine 為Roche公司產品。

1.3 siat7e和st3galⅠ基因擴增方法擴增引物如下:siat7e－F:5’－TTACTCGCCACAAGATGCTG －3’，siat7e－R:5’－GCACCATGCCATAAACATTG －3’;st3galⅠ－F:5’－ GGTGACCCTGCGGAAGAG －3’，st3galⅠ－R:5’－GATTTTATTGATGGAGGC －3’;反應體系為 premix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL;反應條件為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，33 個循環;72 ℃ 10 min。

1.4 轉染與克隆 待細胞長滿，用胰蛋白酶消化收集細胞，用含1%FBS的培養基終止消化離心并棄去上清加入PBS重懸細胞，重復洗滌2～3次，最后將細胞重懸于電轉緩沖液 106cells/90 μL，將載體質粒的濃度調整到1 μg/μL，吸取90 μL 細胞和10 μL質粒充分混勻，將混合液移入0.2 mm電擊杯，150 V 5 ms電擊后將混合液移入6孔板24 h后換液，用含0.8 mg/mL G418的培養基篩選，每3日換液，持續G418篩選2周，可見有抗性細胞生長。對陽性細胞采用有限稀釋法，鋪于96孔板，每3～4日換1次液篩選2周，挑選生長狀態良好的單克隆細胞，繼續用有限稀釋法篩選單個能穩定表達雙基因的細胞株，鑒定為陽性的細胞用胰酶消化后擴大培養并采用常規方法凍存細胞。另取消化后的細胞，按上述方法同步轉染pCMV－GFP載體作為陽性對照。

1.5 陽性克隆的篩選鑒定 挑取14個生長狀態良好的陽性細胞克隆按細胞總RNA提取試劑盒說明書提取各個單細胞克隆總RNA，按反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，再以 cDNA 為模板，siat7e－F、siat7e－R、st3galⅠ－F、st3galⅠ－R為引物，進行RT－PCR鑒定。

1.6 高表達細胞株的篩選

1.6.1 熒光定量 PCR 篩選 對1.5中siat7e、st3galⅠ基因RT－PCR擴增結果均為陽性的細胞克隆用熒光定量PCR進行篩選。同時用GAPDH作為內參進行定量分析。引物與PCR方法如下:

對 1.5 中 siat7e、st3galⅠ基因 RT －PCR 擴增結果均為陽性的細胞克隆用相對熒光定量PCR的方法進行檢測。每個樣品作3個平行對照，同時以超純水代替cDNA模板作空白對照，以母本MDCK細胞制備的cDNA作陰性對照。反應體系:模板1 μL，引物 0.6 μL，Probe 0.4 μL，Mixture 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL;反應循環條件:95℃ 5 min;95℃ 30 s，65℃ 30 s，共40個循環。反應結束后，直接由軟件7500 FAST software(ABI公司)計算出Ct值。取3個重復樣品的平均值，以GAPDH作為內參基因，計算得到目的基因的相對變化倍數(2－ΔΔCt)。1.6.2 流式細胞術篩選 MDCK與陽性細胞克隆株分別鋪于6孔板，各鋪3個孔。待細胞長至90%滿時(每孔細胞約為1.5×106)，胰酶消化，分別收集每孔細胞，加1%FBS的DMEM培養液0.5 mL中和胰酶活性，1000 r/min離心10 min，棄上清，收集細胞沉淀，用含10 mmol/L Glycine的PBS洗2次，再用 Buffer 1(50 mmol/L Tris－HCl、0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L MnCl2、1 mmol/L CaCl2，pH 7.5)洗1次。將配置好的10×Blocking Solution 用 TBS(0.05 mol/L Tris － HCl、0.15 mol/L NaCl，pH 7.5)稀釋10倍，然后用稀釋好的封閉液均勻重懸細胞沉淀，在冰上封閉1 h。之后按上述方法重復洗滌步驟，再分別用高麗槐黃柏甙凝集素(maackia amurensis agglutinin，MAA)、黑接骨木果凝集素(sambucusnigra agglutinin，SNA)及空白對照(即不加一抗)同樣處理MDCK與陽性細胞克隆株，即1 μL 一抗(或不加)于30 μL Buffer 1 中均勻重懸細胞沉淀，冰上孵育1 h。重復洗滌步驟，再用1 μL Anti－digoxigenin －rhodamine于 30 μL Buffer 1中均勻重懸細胞沉淀，冰上孵育1 h，最后PBS洗滌3次后用于流式檢測。

2 結果與分析

2.1 熒光觀察結果 采用Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，通過觀察載體自帶的eGFP熒光蛋白的表達情況，驗證外源基因的表達情況。結果顯示，陽性對照出現明顯的綠色熒光，攜帶 pReceiversiat7e－st3galⅠ真核表達載體的MDCK陽性克隆也觀察到綠色熒光信號，表明轉染成功(圖1)。

2.2 陽性克隆篩選結果 用RT－PCR對14個克隆進行擴增鑒定，結果只有 B3－1、C5、D5、S5－1、CV9 5個克隆兩基因擴增均為陽性(圖2)。

圖2 陽性細胞siat7e和st3galⅠ基因鑒定結果

2.3 熒光定量篩選高表達細胞株 為選擇雙基因均高表達的單細胞克隆株，對RT－PCR條帶較亮的5株細胞進行相對熒光定量檢測。以CV9細胞克隆為參照，以MDCK為陰性對照，以GAPDH基因作為內參基因，經ABI FAST 7500檢測B3－1、C5、D5、S5 －1、CV9 細胞克隆 siat7e和 st3galⅠ基因的表達，結果表明，siat7e、st3galⅠ在5株細胞中均有表達，其中C5細胞株雙基因的表達水平顯著高于其他4株(P＜0.05)(圖3)。

圖3 相對熒光定量篩選結果

2.4 流式檢測結果 為了檢測siat7e和st3galⅠ基因在改造MDCK細胞上的蛋白表達含量，使用地高辛標記的兩種凝集素作為一抗檢測α－2，3及α－2，6連接型受體的表達量:SNA特異性識別2，6連接型唾液酸，MAA特異性識別2，3連接型唾液酸。羅丹明標記抗地高辛抗體為二抗。

挑選2.3中熒光定量PCR檢測基因相對表達量較高的兩個克隆C5和B3－1進一步用流式細胞術進行檢測，同步用未轉染載體的MDCK細胞作為對照。結果顯示B3－1細胞克隆SNA、MAA處理后平均熒光值較MDCK對照無顯著差異，C5細胞克隆SNA處理后平均熒光值由13019變為24554，siat7e基因蛋白水平表達差異顯著(P＜0.05);MAA處理后平均熒光值由7307變為13439，st3galⅠ基因蛋白水平表達差異顯著(P＜0.05)。從RT－PCR鑒定到流式細胞檢測細胞已傳12代，結果表明成功篩選到雙基因穩定高表達的細胞克隆株(圖4)。將C5和B3－1克隆分別命名為MDCK－C5和MDCK－B3－1細胞株。

圖4 流式細胞儀檢測C5、B3-1陽性細胞克隆和MDCK細胞對不同連接型特異性凝集素的反應性

3 討論

本試驗采取相對定量的方法來分析基因的表達量，以消除由于樣品不同導致的mRNA表達水平的差異，本研究采用看家基因GAPDH作為內參基因對所有樣品進行歸一化處理，采用△△Ct方法分別對不同細胞克隆株的雙基因表達情況進行相對定量。然后采用流式細胞檢測技術篩選出雙基因表達量均最高的MDCK－C5細胞克隆株。

基因在mRNA水平的表達不能完全反映蛋白水平的表達，如本試驗中MDCK－B3－1細胞株用熒光定量PCR方法證明mRNA轉錄水平高，但在蛋白表達水平檢測時與陰性MDCK細胞差異不顯著。

Chia Chu等將人的siat7e基因轉染MDCK細胞，經懸浮馴化成功獲得了適應懸浮培養的轉siat7e基因的 MDCK 細胞系［6］。曹文雁等［4］成功構建了穩定表達st3galⅠ基因的MDCK細胞系，其α－2，3連接型受體的豐度顯著高于MDCK細胞，部分禽流感病毒分離株在MDCK－st3galⅠ上形成的蝕斑數量更多、面積更大、形態更為清晰，生長滴度更高。但這些研究構建的細胞系均是單一表達siat7e基因或st3galⅠ基因。本文通過將真核表達載體pReceiver－siat7e－st3galⅠ電擊轉染MDCK細胞后，成功觀察到綠色熒光蛋白的表達，證實該載體已成功轉染至細胞中并成功表達，通過相對熒光定量PCR和流式細胞檢測技術成功篩選到1株雙基因穩定共表達的細胞株。

當前MDCK細胞是培養和分離流感病毒的最佳哺乳動物細胞系之一，但工業生產上大多采用貼壁或微載體懸浮培養，工藝繁瑣易污染，由于MDCK細胞貼壁性能很強很難實現純懸浮培養。該試驗在國內外首次篩選到siat7e和st3galⅠ基因共表達細胞株，為下一步獲得適應懸浮培養和對流感更易感的MDCK細胞株奠定了基礎，為MDCK細胞大規模純懸浮低成本生產流感疫苗作了有益的探索。

［1］ Genzel Y，Reichl U.Continuous cell lines as a production system for influenza vaccines［J］.Expert Rev Vaccines，2009，8:1681－1692.

［2］ Manufacturing of vaccines－cell culture technology gradually replacing egg － based manufacturing［R］.GBI Research Report，2011.

［3］ Jaluria P，Chu C，Betenbaugh M，et al.Cells by design:a minireview of targeting cell engineering using DNA microarrays［J］.Molecular Biotechnology，2008，39(2):105 －111.

［4］ 曹文雁.穩定表達雞st3galⅠ的MDCK細胞系的建立［D］.北京:中國農業科學院，2008.

［5］ 陳小云，張 敏，張啟龍，等.siat7 e基因和st3galⅠ基因雙表達載體的構建及其初步應用［J］.中國獸藥雜志，2013，47(4):6－9.

［6］ Chu C，Lugovtsev V，Golding H，et al.Conversion of MDCK cell line to suspension culture by transfecting with human siat7e gene and its application for influenza virus production［J］.PNAS，2009，106:14802－14807.