搜風祛痰法對ApoE基因敲除小鼠主動脈易損斑塊炎癥反應及PPARγ基因表達的影響*

安 毅 宮麗鴻 魏偉超

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110000）

動脈粥樣硬化（AS）是發生在大中型動脈壁的炎癥性疾?。?］，作為心血管疾病的重要病理基礎與心血管事件的發生密不可分。過氧化體增殖物激活型受體（PPAR），已成為近幾年動脈粥樣硬化的研究熱點，作為轉錄調節因子，PPAR參與脂質代謝、炎癥及動脈粥樣硬化［2］。PPARγ作為PPAR這一類配體激活的核轉錄因子超家族成員的表型之一，研究最為深入。PPARγ的功能廣泛，參與體內眾多生理和病理反應的調節，如糖代謝、脂肪代謝及細胞分化［3］。搜風祛痰中藥復方穩斑湯在臨床上抗動脈粥樣硬化及穩定斑塊作用顯著，本研究則在此基礎上觀察其對動脈粥樣硬化ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊內炎癥反應的影響如何，以及對動脈組織中PPARγ基因表達的干預作用，從而探討搜風祛痰中藥復方穩斑湯抗AS發生發展的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ApoE（-/-）小鼠和正常C57BL/6 J小鼠，6～8 周齡，SPF 級，體質量 18～20 g（北京大學實驗動物中心美國Jackson實驗室引進并培育成功）。

1.2 藥物與試劑 穩斑湯組成：全蝎10 g，蜈蚣1條，地龍 15 g，陳皮 15 g，半夏 15 g，白術 15 g，水蛭 15 g。由遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL中藥濃縮液備用；阿托伐他汀（輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051409，規格：20 mg）。HE染色主要試劑：蘇木精染液、伊紅染液等（購自北京博奧森生物科技有限公司）；兩步法RT-PCR試劑盒（購自北京全式金生物技術有限公司）；DNA maker（購自北京全式金生物技術有限公司）；Trizol（購自invitrogen公司）；引物（由北京三博遠志生物技術有限公司代為合成）。

1.3 造模與分組 造模小鼠飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飼料（60Coγ滅菌照射處理），根據文獻［4］同時對小鼠進行足底電流刺激，13周后，隨機處死4只，去主動脈根部，HE染色觀察基礎AS硬化程度，確定造模成功。ApoE基因敲除小鼠60只隨機分為5組，模型組、西藥組及穩斑湯低、中、高劑量組各12只。正常C57BL/6 J小鼠12只正常飼料喂養13周，設為空白組。

1.4 給藥方法 根據成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質量折算系數9.0折算成小鼠用量：穩斑湯低劑量組 61.75 g/（kg·d），穩斑湯中劑量組 123.5 g/（kg·d）， 穩斑湯高劑量組 247 g/（kg·d），西藥組予阿托伐他汀0.27 g/（kg·d），正常組與模型組給予生理鹽水0.3 mL/d。

1.5 標本采集及檢測 取材前夜禁食，處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及主動脈，心臟10%甲醛固定，主動脈放在凍存管內，置于液氮中，后轉移到-80℃保存備用。主動脈組織病理學觀察，每組隨機取5只小鼠，麻醉處死，無菌條件下于主動脈根部取4個相同切面，生理鹽水沖洗，10%甲醛中性溶液固定，組織常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度 5 μm，切片行HE染色，光鏡下觀察主動脈的形態。半定量RT-PCR法測定血管壁PPARγ和TLR4基因表達?？俁NA抽提按invitogen公司生產的trizol說明書。最后用適量DEPC處理水溶解沉淀RNA樣品，-80℃保存備用，PPARγ引物由北京三博遠志生物技術有限公司代為合成。GAPDH為內參，引物序列見表1。操作嚴格按照RT-PCR試劑盒說明書進行RNA提取、逆轉錄及PCR，并且進行瓊脂糖電泳，成像記錄。

表1 基因引物序列

1.6 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件處理。計量資料以（）表示，組間比較用t檢驗，多組均數比較用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠主動脈組織形態學改變 見圖1?？瞻讓φ战M：動脈內膜附有一層內皮細胞，內皮細胞層呈現皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細胞及炎性細胞。模型對照組：血管腔內可見明顯的粥樣硬化斑塊出現，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細胞、彈力纖維和膠原組織構成，斑塊中央可見大量的脂質聚集，斑塊內可見大量泡沫細胞，偶見炎性細胞浸潤，未出現斑塊的動脈內膜區域嚴重破損。中藥低劑量組：血管腔內可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對照組，斑塊內脂質含量較模型組少，斑塊內可見少量泡沫細胞及炎性細胞，偶見內膜殘缺。中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組：動脈內膜大部分較為光滑，偶見內膜不全，內膜不全區域可見明顯的脂質條紋塊形成，偶見泡沫細胞聚集，有少量纖維成分交聯。

圖1 各組小鼠腹主動脈HE染色（100倍）

2.2 各組小鼠腹主動脈PPARγ基因表達水平 見圖2，表2。各組ApoE基因敲除小鼠半定量RT-PCR結果表明：與空白組相比，模型組PPAR-γ mRNA表達水平明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，西藥組和穩斑湯各劑量組均能提高PPAR-γ mRNA表達水平 （P＜0.01）；與西藥組相比，穩斑湯高劑量組提高PPAR-γ mRNA表達水平與其無差異（P＞0.05）。

圖2 PPAR-γ mRNA表達

表2 各組小鼠腹主動脈組織中PPAR-γ mRNA表達水平（）

表2 各組小鼠腹主動脈組織中PPAR-γ mRNA表達水平（）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

3 討 論

AS作為炎癥性疾病，炎癥反應貫穿于AS發生、發展及斑塊破裂血栓形成的全過程，是引起動脈壁不穩定斑塊及相應并發癥的中心環節［5］。在這一過程中大量的炎性因子參與其中，如TNF-α作為重要的炎性介質可通過促進MMPs表達，使纖維帽變薄，斑塊趨于不穩定，此外，TNF-α還可以通過活化內皮細胞、氧化應激、血小板聚集、血栓形成來誘發ACS的發生［6］。

大量研究表明PPARγ是一個炎癥反應和細胞增值的調節劑，在巨噬細胞、內皮細胞及平滑肌細胞中均有表達，它對炎癥介質進行負反饋調節，抑制炎癥因子的生成及炎癥的形成，抗感染作用廣泛而強大［7］。當巨噬細胞被激活后，PPARγ表達水平升高，通過阻止清道夫受體A、可誘導性NO合成酶及明膠酶B等的分泌來減少單核細胞分泌的IL-6、TNF-α等炎性因子，從而限制慢性炎癥，在斑塊區發揮抗炎作用。本研究通過光鏡觀察到中藥各劑量組和西藥組斑塊區的炎癥反應均明顯弱于模型組；動脈粥樣硬化ApoE基因敲除小鼠模型組PPARγ基因僅有少量表達，并不足以阻止動脈粥樣硬化的發生發展，而中藥穩斑湯各劑量組及西藥他汀組均能不同程度地增加PPARγ基因表達（P＜0.01或 P＜0.05），從而使 PPARγ基因活化。

搜風祛痰法中藥復方穩斑湯，其方中搜風藥為蟲類，走竄力強，佐以健脾燥濕化痰之藥。全方共奏搜風祛痰、祛瘀通絡之功效?，F代藥理學研究顯示：全蝎可增強心肌收縮力、擴張血管、抗血栓形成；地龍可激活纖維酶原；蜈蚣擴張血管同時亦可抗心肌缺血；水蛭有較強的抗凝血作用，能改善血液流變學；陳皮對心血管系統有降脂作用，減少炎癥反應、抗血小板聚集；半夏對高脂血癥有治療作用；白術能夠減輕心肌耗氧、改善心肌血供。本實驗結果表明搜風祛痰中藥復方穩斑湯可以使血管壁PPARγ基因激活，減輕動脈粥樣硬化的炎癥作用，穩定易損斑塊。揭示搜風祛痰穩斑湯對PPARγ的上調作用，可能是搜風祛痰中藥復方穩斑湯抑制斑塊內炎癥反應發揮抗動脈粥樣硬化作用的機制之一。

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［4］倪梅.易損斑塊動物模型的構建和基因治療穩定易損斑塊的實驗研究［D］.濟南：山東大學，2007.

［5］Libby P.Inflammation in atherosclerosis［J］.Arteriosclerosis，thrombosis，and Vascular Biology，2012，32（9）：2045-2051.

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