兔骨髓間充質干細胞的鑒定及向血管內皮細胞的分化

孔根現 李 麗 蔣知新 張清華 (南方醫科大學研究生學院，廣東 廣州 5055)

骨髓間充質干細胞(BMSCs)起源于中胚層，可誘導分化為成骨細胞，軟骨細胞，脂肪細胞，神經細胞，肝細胞等多種細胞〔1〕，且具有低免疫原性，對多種免疫細胞具有調控功能〔2〕，是目前研究最熱的成體干細胞。在胚胎發育過程中，血管內皮細胞(VECs)是由中胚層干細胞分化而來，在血管重建修復損傷組織過程中具有重要作用，因而誘導BMSCs定向分化為VECs在構建血管組織工程方面具有重要意義。血管內皮細胞生長因子(VEGF)對體外誘導MSCs分化為VECs具有重要作用，如果培養基中失去了 VEGF，那么 VECs的特征就難以維持〔3，4〕，而堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)具有促進血管生成、損傷修復、神經修復等作用〔5，6〕，且對中胚層和神經外胚層來源干細胞的增殖和分化具有重要作用，是誘導MSCs分化為VECs必不可少的因子之一〔1，7，8〕。本實驗聯合應用 VEGF 和 bFGF，體外誘導BMSCs定向分化為VECs，并探索提高誘導率的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 L-DMEM培養基及胎牛血清(GIBCO)，胰蛋白酶(Sigma)，磷酸鹽緩沖液(HyClone)，雙抗(HyClone)，CD45 抗體(PE)及其二抗(SANTA CRUZ)，CD29、CD34、CD90單抗(FITC)和同型對照抗體(Abcam)，VEGF和bFGF(上海博邁生物科技)，CD31抗體及FITC標記的同型對照抗體(Bioss)，NO檢測試劑盒(北京普利萊)，細胞培養皿、細胞培養瓶及培養板(Corning)，細胞培養箱(SANYO)，流式細胞儀(Beckman)，倒置顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 實驗動物 健康純種新西蘭大白兔，雌雄不限，4～5周齡，體重1 kg左右，用于提取MSCs，由解放軍海軍總醫院實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 兔BMSCs的分離培養 穿刺抽取股骨及脛骨骨髓，用密度梯度離心法〔9〕獲取 BMSCs，接種于培養皿中，放入37℃、5%CO2的培養箱中培養。48 h后首次換液，棄去未貼壁及死亡細胞，此后每3 d換1次液，細胞融合達80%～90%時，以1∶3的比例傳代。倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照記錄。

1.3.2 流式檢測BMSCs表面抗原 P3代細胞融合達80%左右時，消化計數，重懸細胞濃度為1×107/ml，每個流式管取100 μl細胞懸液，分別加入 2 μl濃度為 2 g/L 的 CD29、CD34、CD45、CD90抗體及同型對照抗體，4℃避光孵育30 min，加入細胞洗液漂洗2次，去上清，控干后每管加入0.5 ml固定液，混勻。檢測時，先做同型對照，調整電壓至陰性區范圍，再測實驗管。

1.3.3 成骨和成脂誘導以及染色 取第3代對數生長期的細胞，消化計數，重懸細胞濃度為1×104/ml，接種于六孔板中常規培養，待細胞貼壁融合達到約80%時，對照組不變，實驗組移去原培養液，每孔加入2 ml誘導培養液，每3天換一次液，成骨誘導21 d茜素紅染色鑒定，成脂誘導15 d油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.4 BMSCs向VECs誘導分化 擴增至第3代的細胞消化后以1×104/ml接種于6孔板中，次日換液，實驗組(A、B兩組)加入誘導培養液(10%FBS的L-DMEM培養基中含20 μg/L的 VEGF、10 μg/L 的 bFGF)2 ml，第 15 天，A 組以 1∶2傳代，B組不變，兩組均誘導24 d;對照組(C組)常規培養。鏡下觀察細胞形態變化并拍照記錄。

1.3.5 CD31抗原流式檢測 誘導第24天，流式分析細胞表面CD31抗原的表達(方法同1.3.2)。

1.3.6 NO分泌量的檢測 細胞誘導24 d后，取上清液，儲存于-80℃冰箱內。檢測時，96孔板中每孔加入50 μl標準品或樣品，而后加入50 μl Griess R1，室溫避光放置5 min，再加入50 μl Griess R2，室溫避光放置5 min后應用 XD711酶標儀540 nm測定吸光度;以平均吸光度OD值為x軸，標準品濃度為y軸，用Excel作圖得到標準曲線公式，將樣品OD值代入公式計算NO濃度。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統計處理，方差齊性時采用單向方差分析，組間的多重比較采用LSD法，方差不齊時采用Welch近似方差分析，組間的多重比較采用Dunnett T3法。

2 結果

2.1 BMSCs形態特點 原代細胞多為圓形和梭形，成集落樣生長，8～10 d細胞融合可達80% ～90%，經換液及貼壁篩選，細胞純度不斷提高，擴增至第3代時，細胞狀態最佳，鏡下見細胞形態均一，魚群狀排列，呈典型的梭形(圖1)。

2.2 BMSCs表面抗原的表達 BMSCs高表達CD29和CD90，陽性率分別為98.21%和86.20%，低表達CD34和CD45，陽性率僅為0.36%和2.03%。

2.3 成骨和成脂誘導染色 成骨誘導21 d茜素紅染色，實驗組可見散在的深紅色鈣結節，C組無明顯改變;成脂誘導15 d油紅O染色，實驗組可見含有紅色脂滴的脂肪細胞，C組未見脂肪細胞(圖2)。

2.4 BMSCs向內皮誘導后形態變化 加入誘導培養基后，細胞增殖的同時形態逐漸由長梭形轉變為短梭形，最后形成以圓形和橢圓形為主外觀為“鋪路石”狀的細胞群(圖3)。

2.5 CD31分子流式檢測 誘導24 d后，CD31陽性率A組為57.3%，B 組為43.8%，C 組為0.8%。

2.6 NO分泌量的檢測 誘導后A、B、C三組NO的分泌量分別為 (103.91 ± 11.91)μmol/L，(91.59 ± 6.91)μmol/L 和(3.95±1.43)μmol/L。方差齊性檢驗顯示方差不齊(F=10.083，P＜0.05);Welch近似方差分析顯示三組細胞NO分泌量的總體均數不全相等(P＜0.05)，進一步的組間多重比較顯示三組細胞兩兩之間的差異均具有顯著性(P＜0.05)。

圖1 BMSCs的形態特點

圖2 成骨和成脂誘導染色

圖3 內皮化誘導后細胞形態

3 討論

內皮細胞是心腦血管疾病發病的關鍵所在，VECs損傷是心腦血管疾病的主要危險因素之一，因而對VECs損傷的修復具有積極的意義。Herring等〔10〕提出過運用自體VECs構建人工血管的技術方法，但取材數量有限且體外擴增后細胞活性和功能下降，因而得不到推廣;胚胎干細胞能夠穩定擴增且具備多向分化潛能，但其獲取和建系必須破壞胚囊，從而引起了諸多關于倫理道德的爭論。BMSCs具有多向分化潛能，來源廣泛，不存在倫理道德問題，是VECs來源的理想種子細胞。

目前已建立了多種誘導BMSCs分化為VECs的體系，主要包括損傷組織微環境誘導體系，內皮細胞共培養誘導體系，細胞因子聯合誘導體系等。損傷組織微環境誘導體系是利用損傷組織缺血缺氧等特殊的微環境作用誘導BMSCs分化為VECs，多用于 MSCs的體內實驗研究〔11，12〕;內皮細胞共培養誘導體系是通過將BMSCs與內皮細胞共同培養來誘導BMSCs的分化，一般在三維培養系統中進行〔13〕;細胞因子聯合誘導體系是指在培養基中添加兩種或兩種以上的細胞因子來誘導BMSCs向VECs分化，其中VEGF是必不可少的誘導因子，bFGF是最為常見的輔助因子。前兩種體系在操作和分析方面相對復雜，并且許多研究表明損傷微環境和共培養體系中發揮誘導作用的物質主要是細胞因子，所以細胞因子聯合誘導體系越來越受到研究者的重視。

但是，細胞因子聯合誘導體系存在誘導效率相對較低的問題。許多學者針對此問題進行了相關探索，并提出了一些解決方案，包括基因轉染，添加活性物質等〔8，14〕，而傳代對誘導效率影響的報道卻比較少見。實驗中，本研究將BMSCs誘導分化為了VECs，并且發現誘導過程中進行傳代能夠提高CD31的表達和NO的分泌量，經過統計分析差異具有顯著性。從而證實了聯用VEGF和bFGF誘導BMSCs分化為VECs的可行性，也提示了傳代能夠提高該過程的誘導效率，為提高誘導效率提供了一條簡單有效的途徑。

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