絞股藍皂苷對2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織脂質沉積的影響

賀 琴 李德梅 李敬會 譚華炳 (湖北醫藥學院附屬人民醫院感染性疾病科，湖北 十堰 442000)

我國已成為僅次于印度的糖尿病第二大國，預計到2025年兩國將各有2億人口罹患糖尿病〔1〕，其中95%為2型糖尿病(T2DM)。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是脂肪肝(FLD)主要類型。NAFLD已成為發達國家和地區第一大肝病，在我國亦可能成為慢性肝病的首要病因〔2〕。T2DM患者NAFLD檢出率為 50.45%〔3〕;NAFLD 導 致 T2DM〔4～6〕;說 明 T2DM 與NAFLD互為因果。絞股藍及絞股藍皂苷(GPS)能降低NAFLD兔肝臟脂質沉積量〔7〕，有治療 T2DM、代謝綜合征作用〔8，9〕。本研究通過高脂飼料飼養聯合鏈脲佐菌素(STZ)注射建立T2DM并NAFLD模型，觀察GPS對T2DM并NAFLD大鼠肝臟脂質沉積量影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及場地 65只SPF級雄性SD大鼠，體質量220～250 g，由湖北醫藥學院動物實驗中心提供〔合格證號:No.scxk(湘)2009-0004〕。實驗場地湖北省十堰市實驗動物中心(湖北省實驗動物設施使用證明號:00015644)。

1.2 實驗飼料 普通飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心提供。膽固醇購自北京雙旋生物培養基制品廠。豬油由市售板油自行煉制而成，蛋黃粉由市售雞蛋自行制作。高糖高脂飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心按實驗配方配制成成品使用(配方:78%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油+4.5%蔗糖)。高脂飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心按照實驗設計配方配制成成品使用(配方:82.5%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油)。

1.3 材料及設備 甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、血糖(GLU)檢測試劑為瑞士Roche/Hitache公司原裝進口試劑。STZ購于美國Sigma公司。GPS購自安康東科麥迪森天然藥業有限公司，純度為98%。全自動生化檢測儀(瑞士產，Roche/Hitache7600)。冷凍低溫離心機(上海中科生物醫學高科技開發有限公司，DL-45R-L)。Olympus DP-70顯微攝影系統(日本，奧林巴斯公司)。德國產組織勻漿機。

1.4 實驗模型的建立

1.4.1 實驗動物的分組 SD大鼠購入后，普通飼料飼養觀察1 w，動物無死亡及不良反應。按照實驗設計將65只大鼠分為空白對照組(7只，N組)，NAFLD模型組(NM組，7只)，T2DM并NAFLD模型組(51只)。

1.4.2 T2DM并NAFLD造模與干預 參照文獻〔10〕，每鼠每天高糖高脂飼料20 g左右，分兩次投入，喂養4 w;大鼠隔夜空腹腹腔注射 STZ 40mg/kg，48h后尾靜脈取血，GLU＞11.1 mmol/L，納入實驗組，造模成功率為100%;繼續給予高糖高脂飼料喂養至8 w，期間大鼠死亡15只。將全部大鼠分為GPS大劑量組(9只，JH組)，給予GPS 1 g·kg-1·d-1灌胃;GPS小劑量組(9只，JL組)，給予 GPS 0.5 g·kg-1·d-1灌胃;T2DM并NAFLD模型對照組(9只，M組)同等體積的純凈水灌胃;繼續給予高糖高脂飼料，自由飲水;治療周期為6 w;實驗周期14 w。

1.4.3 N組、NM組飼養與管理 N組每天給予普通飼料20 g左右(根據NAFLD組進食量調整);NM組給予高脂飼料20 g左右(依據前1 d進食量決定第2天進食量);飼料分2次投入。自由飲水。實驗周期14 w。

1.5 標本的采集與檢測

1.5.1 血液標本的采集與處理 試驗結束時，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露腹主動脈，腹主動脈采集血液10 ml于肝素管，離心取血清，保存于-20℃的冰柜中待檢。

1.5.2 血清TG、TC、BLU，肝組織TG檢測 同步按儀器和試劑說明書要求，檢測血清TG、TC、GLU，肝組織TG。

1.5.3 肝組織勻漿的制備 在肝臟最大葉邊緣0.5 cm處取小塊肝組織一塊，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取0.5 g置于預冷的5 ml生理鹽水，迅速用內切式勻漿機4 000 r/min勻漿10 s/次，間隙30 s，連續3次，碎冰塊中制成10% 的肝勻漿，高速冷凍離心機4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清3 ml密封，-20℃冷存待檢。

1.5.4 肝臟病理學檢測 在肝臟最大葉，取肝組織0.5 cm，常規固定、切片、HE染色，檢測肝臟病理學變化。

1.6 統計學處理 所有數據采用SPSS 9.0統計學軟件處理，數據以s表示，治療前后組內及組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 實驗過程中大鼠數量變化 模型組在T2DM并NAFLD造模過程中，死亡大鼠15只，死亡率為29.41%;實驗過程中，JH組、JL組、M組分別有1、2、3只大鼠死亡，實驗結束JH組有8只，JL組有7只，M組有6只。NM組有6只。N組實驗過程中無死亡。實驗開始有65只，實驗結束時有41只。

2.2 GLU變化 見表1。NM組與JH組、JL組、M組差異顯著(P＜0.01);NM 組與 N 組存在顯著差異(P＜0.01)。

表1 模型組、干預組與對照組TG、TC、肝組織TG(s)

表1 模型組、干預組與對照組TG、TC、肝組織TG(s)

與 NM 組比較:1)P＜0.01;與 N 組比較:2)P＜0.01;與 M 組比較:3)P＜0.05

組別 n GLU(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)肝組織TG(mg/g)JH 組 8 13.12±1.081)2.64±0.482)3)6.88±1.112)3)142.87±6.642)JL 組 7 15.55±1.151)3.21±0.592)3)8.26±0.892)3)164.92±7.562)M 組 6 21.68±1.241)4.98±0.592)10.12±1.262)214.46±5.442)NM 組 6 7.92±0.72 3.56±0.412)7.98±1.022)198.46±6.982)N 組 7 4.98±0.441) 0.85±0.19 2.12±0.15 28.98±1.68

2.3 TG、TC變化 與N組比較，NM組、JH組、JL組、M組TG、TC 上升(P＜0.01)，JH 組、JL 組低于 M 組(P＜0.01)。見表1。

2.4 肝組織TG濃度 與N組比較，NM組、JH組、JL組、M組肝組織TG上升(P＜0.01)。見表1。

2.5 肝臟病理學 N組為正常肝臟，NM組為重度FLD，MFLD程度最嚴重;JL與NM組程度相似;JH組FLD程度最輕。見圖1。

圖1 各組肝臟病理學改變(HE，×400)

3 討論

NAFLD與T2DM互為因果，已經得到公認。本實驗NAFLD模型對照大鼠存在GLU升高也說明這一點。T2DM與NAFLD在發病機制上存在“共同土壤”胰島素抵抗(IR)而成為其重要病因〔10〕。在糖尿病患者中，血漿游離脂肪酸(FFA)水平升高，TG增高，HDL水平降低，引起脂代謝紊亂，大量脂肪進入肝細胞，在肝內蓄積，形成脂肪沉著及肝細胞變性、腫大形成脂肪肝〔11〕。肝臟內的脂肪沉積又導致 IR，形成惡性循環，加重糖、脂代謝紊亂，促進FLD形成〔12〕。改善糖代謝紊亂、調節血脂代謝、減少TG在肝臟的沉積，對治療T2DM并NAFLD具有重要意義。

中醫認為T2DM合并NAFLD是由于濕熱內蘊、痰瘀互結;西醫“共同土壤學說”提出高血糖、血脂異常、胰島素抵抗、T2DM與慢性全身性低度炎癥狀態及氧化應激有關。炎癥因子C反應蛋白(CRP)在肝臟合成，FLD與CRP異常有關〔6〕。現代藥理研究證明絞股藍含有83種與人參皂苷有類似骨架的達瑪烷型GPS，皂苷具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫調節等多方面的生物活性和藥理作用〔13〕，Norberg等〔14〕從絞股藍中分離提純出一種新的皂苷，存在4種可以相互轉化的立體異構體，在體外及動物實驗中均發現，其可刺激胰島細胞釋放胰島素，且呈現劑量依賴性。Xu等〔15〕對絞股藍中分離得到的皂苷及其衍生物的降糖作用進行了研究，發現其可以通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶來控制胰島素的敏感度，結合絞股藍對CRP升高有抑制作用、能降低兔肝臟脂質沉積量，說明絞股藍及GPS具有多靶點干預T2DM并NAFLD作用。

1 Yoon KH，Lee JH，Kim JW，et al.Epidemic obesity and type 2 diabetes in Asia〔J〕.Lancet，2006;368(9548):1681-8.

2 周婷婷，秦 波，鄭天鵬，等.非酒精性脂肪肝患者血漿FGF21水平及與肥胖、胰島素抵抗關系研究〔J〕.第三軍醫大學學報，2010;32(3):265-8.

3 李勇杰，蘇宏業，李圣琦.2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝檢出率及臨床特點〔J〕.廣西醫學雜志，2012;34(1):86-8.

4 謝杏榕，譚華炳，胡小林，等.不同程度非酒精性脂肪性肝病兔的血糖變化〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(2):636-7.

5 譚華炳，李金科，胡 波，等.非酒精性脂肪性肝病兔胰島素水平變化及其機理探討〔J〕.西南國防醫藥雜志，2010;20(9):937-9.

6 譚華炳，賀 琴.脂肪肝與血液流變學、C反應蛋白異常的關系〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(13):1662-4.

7 劉其政，孫希杰，譚華炳，等.絞股藍抑制非酒精性脂肪性肝病兔肝臟脂質沉積的實驗研究〔J〕.中西醫結合肝病雜志，2011;21(4):224-6.

8 賀 琴，譚華炳.絞股藍防治2型糖尿病及心腦腎并發癥研究進展〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2008;6(8):957-8.

9 譚華炳，賀 琴.絞股藍防治代謝綜合征研究進展〔J〕.遼寧中醫雜志，2008，;35(7):1115-6.

10 王戰建，張 耀，宋慶芳，等.二甲雙胍對高糖高脂飲食誘導的糖尿病大鼠脂肪肝治療作用的研究〔J〕.中國實用內科雜志，2006;26(20):1603-5.

11 范建高，曾民德.脂肪性肝病〔M〕.北京:人民衛生出版社，2005:220.

12 Reid AE.Nonalcoholic steatohepatitis〔J〕.Gastroenterology，2001;121(3):710-23.

13 李勇杰，蘇宏業，李圣琦.2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝檢出率及臨床特點〔J〕.廣西醫學雜志，2012;34(1):868.

14 Norberg A，Hoa NK，Liepinsh E，et al.A novel insulin-releasing substance，phanoside，from the plant Gynostemma pentaphyllum〔J〕.J Biol Chem，2004;279(40):41361-7.

15 Xu JQ，Shen Q，Li J，et al.Dammaranes from Gynostemma pentaphyllum and synthesis of their derivatives as inhibitors of protein tyrosine phosphatase1B〔J〕.Bioorg Med Chem，2010;18(11):3934-9.