PTEN，HIF-1α和VEGF在食管鱗癌組織中的表達及其意義

竇鵬揮 邢雨彤 周 鋼 朱曉峰 鄒志田 (佳木斯大學附屬第一醫院心胸外科，黑龍江 佳木斯 154002)

食管癌是我國高發的消化系統惡性腫瘤之一，因其惡性度高，5年生存率僅20%左右〔1〕。目前因其確切病因及發病機制仍不明確，治療方法大都采用手術結合大劑量放、化療法，由于反復多次的放、化療導致患者免疫功能下降，尤其是患者抵抗力降低，容易轉移，從而加速了患者死亡;早期發現和針對其早期浸潤轉移入手而進行有針對性的治療是該病治療成敗的關鍵〔2〕。目前公認的腫瘤性疾病實質上是一種多基因病〔3〕。目前對于PTEN、VEGF與HIF-1α在食管鱗癌中的共同表達情況及其相關性研究，在國內外尚未見報道。本研究利用RT-PCR、免疫組化技術研究PTEN、缺氧誘導因子(HIF)-1α及VEGF在食管鱗癌組織中的表達情況，分析三者與食管鱗癌臨床病理因素的關系及其相關性，探討各自功能、相互聯系及其與食管癌發生發展機制的關系。

1 實驗方法

1.1 材料 選取我院2010年10月至2013年10月收治的71例食管鱗癌患者組織樣本(所有病例術前均未經過任何放化療及激素治療)，年齡62～84〔平均(72.8±3.1)〕歲;其中16例Tis(原位癌)，24例T1期(只侵及黏膜固有層和下層)，15例T2期(侵及肌層)，9例T3期(侵及食管纖維膜)，7例T4期(侵及鄰近器官區域)。另收集20例T0期正常組織作為對照，根據患者病理分期將其隨機分成四組，四組患者在年齡、性別、病變長度及淋巴結轉移情況均不具有顯著性差異(P＞0.05)，具有可比性。抗體采用兔多克隆VEGF抗體(abcam，美國)，S-P試劑(Maixin，中國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫組化(SP法)操作步驟 切片常規脫蠟至水，并進行抗原修復，緩沖液洗3 min/2次。滴加Ultra V Block，在室溫下孵育5 min以封閉非特異性的背景染色。緩沖液洗5 min/2次。滴加一抗工作液37℃孵育1～2 h。緩沖液洗5 min/2次。滴加 Primary Antibody Enhancer(增強子)，在室溫下孵育20 min。緩沖液洗5 min/2次。滴加 HRP Polymer(酶標二抗)，在室溫下孵育30 min。緩沖液洗5 min/2次。滴加DAB Plus Substrate到切片上，孵育3～15 min。自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片，拍照。

1.2.2 RT-PCR操作步驟 采用RT-PCR檢測PTEN、HIF-1α及VEGF基因的轉錄表達:取各例實驗材料一部分，用于提取總RNA。同時針對上述3個基因設計PCR引物，利用RT-PCR試劑盒檢測個樣本中各個基因的轉錄表達情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS14.0軟件，組間樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗和ANOVA方差分析。

2 結果

2.1 食管鱗癌患者組織內PTEN和HIF-1α表達量特點PTEN mRNA和HIF-1α mRNA表達水平通過棕色顆粒表達，多存在于腫瘤細胞的細胞質和內皮細胞和血管細胞質中，測量PTEN、HIF-1α mRNA及VEGF在食管鱗癌患者組織中的表達量顯示，在不同病理分級患者組織中，各表達量均具有顯著性差異，PTEN 在 T0、Tis組(0.178 2±0.027 1)及 T1和 T2組(0.168 3±0.039 7)患者中表達量比 T3和T4組(0.147 0±0.052 4)患者中的表達顯著增高(P＜0.05)，HIF-1α表達在T3+T4組中的表達量(0.233 5±0.074 8)比 Tis(0.102 9±0.045 7)及T1+T2組(0.165 6±0.032 9)患者顯著增高，且均大于T0組患者表達量。HIF-1α和VEGF的變化趨勢相似。見圖 1，圖 2。

圖1 食管鱗癌及正常組織中PTEN、HIF－1α、VEGF表達(S-P法，×400)

圖2 食管鱗癌患者組織內PTEN、HIF-1α及VEGF表達量(RT-PCR)

2.2 PTEN，HIF-1α，VEGF與食管鱗癌相關性研究 PTEN的表達與 HIF-1α VEGF的表達均具有顯著相關性(r=－0.36，－0.68，均 P＜0.05)，而 HIF-1α 的表達量與 VEGF 表達量同樣具有顯著相關性(r=0.72，P＜0.05)。

3 討論

PTEN基因(MMAC1)是具有磷酸酶活性的抑癌基因，可通過抑制腫瘤細胞浸潤和促進細胞凋亡等多種途徑發揮抗癌作用，目前研究報道〔4，5〕了一些關于PTEN蛋白表達與食管癌關系的研究，而關于PTEN基因突變頻率與食管癌的關系研究較少。HIF-1α是介導細胞對缺氧微環境進行適應性反應的關鍵性轉錄調控因子，于振濤等〔6〕研究表明HIF-1α不僅促進VEGF轉錄，也增強VEGF mRNA的穩定性，最終導致增加腫瘤血管生成。Mizokami等〔7〕研究表明，腫瘤抑制基因PTEN即具有抑制HIF-1α表達和降低HIF-1α穩定性的作用，腫瘤細胞中如果PTEN失活將不能阻斷 HIF-1α的表達。故文獻〔8〕顯示HIF-1α在肺癌組織中表達特點是:與病理分期有關，分期越高表達越多;與淋巴轉移是否轉移無相關性;PTEN蛋白表達均與HIF-1α蛋白表達呈負相關。這與本文研究結果相符。VEGF是血小板源性生長因子(PDGF)家族的一個成員，也是迄今所發現的最重要的促血管生成因子。VEGF基因的表達受缺氧、多種細胞因子，類固醇激素，瘤基因，抑瘤基因產物及一些小分子物質等因素的調控。目前關于VEGF和HIF-1α共同表達的關系及相關性在胃癌、肝癌、子宮內膜癌、乳腺癌等研究〔9，10〕中有相關報道。

本研究發現，PTEN、VEGF與HIF-1α基因在所有食管鱗癌患者組織中的表達量與腫瘤分期具有顯著相關性，預示這三種蛋白的表達可能與食管鱗癌的治療和預后具有顯著關系，為開發新的抗食管癌藥物、尋找新的基因治療靶位提供理論依據，同時為臨床治療食管癌提供新的思路。

1 Vasudevan KM，Burikhanov R，Goswami A，et al.Suppression of PTEN expression is essential for anti-apoptosis and cellular transformation by oncogenic ras〔J〕.Cancer Res，2007;67(21):10343-50.

2 Gao P，Wange RL，Zhang N，et al.Negative regulation of CXCR4-mediated chemotax is by the lipid phosphatase activity of tumor suppressor PTEN〔J〕.Blood，2005;106(8):2619-26.

3 Huang J，Kontos CD.PTEN modulates vascular endothelial growth factormediated signaling and angiogenic effects〔J〕.J Biol Chem，2002;277(13):10760-6.

4 朱 紅，周龍明.肝癌組織PTEN基因及其相關因子HIF-1α表達的研究〔J〕.交通醫學，2010;24(4):369-74.

5 戴珍珍，叢玲華.PTEN和HIF-1α蛋白在肺癌組織中的表達及相關性研究〔J〕.全科醫學臨床與教育，2011;9(1):8-10.

6 于振濤，趙華鋒，尚曉濱，等.鱗癌中缺氧誘導因子－1α、血管生成因子在食管鱗癌中的表達及臨床病理意義〔J〕.中華醫學雜志，2008;88(35):2465.

7 Mizokami Y，Li J，Zhang X，et al.Hypoxia-inducible factor-1 independent regulation of vascular endothelial growth factor by hypoxia in colon caneer〔J〕.Cancer Res，2004;64(5):1765-72.

8 沈承瀾，沈振斌.血管內皮生長因子、缺氧誘導因子-1α在胃癌中的表達及其對預后影響的研究〔J〕.中國全科醫學，2010;13(8A):2460-6.

9 鄭青平，陳龍華.肝癌組織VEGF、HIF-1α和MMP-2表達的臨床研究〔J〕.廣西醫藥，2008;30(3):301-10.

10 孟曉云，陳 躍.Glut1、VEGF、HIF-1α在乳腺癌中的表達和臨床意義〔J〕.中國現代醫學雜志，2008;18(11):1557-64.