肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達

魏 明 涂 玲 梁穎紅 劉 佳 張俊華 龔艷杰 (鄭州大學第五附屬醫院檢驗科，河南 鄭州 450052)

在腫瘤的治療中，目前困擾臨床醫生的主要問題仍是腫瘤的復發與轉移。為此本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術對不同臨床分期和類型的肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達水平進行檢測，探討其對肺癌微轉移診斷和監測的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 肺癌患者60例，男46例，女14例。平均年齡57.8歲，均經病理組織切片確診。其中小細胞肺癌10例，腺癌22例，鱗癌28例;Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ期30例，Ⅳ期18例。肺良性病變組42例，男28例，女14例，平均年齡56.7歲，其中肺大泡21例，支氣管擴張21例。健康對照組60名，男45例，女15例，平均年齡57.1歲，均為健康體檢者。

1.2 實驗方法 外周血RNA的提取:采集受檢者EDTA抗凝血5 ml，用QiaAmp試劑盒(美國 Qiagen公司)，按試劑盒說明書提取全血RNA，凍存于-80℃備用。

1.3 熒光定量PCR檢測CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA CEA mRNA、CK19 mRNA和 CK20 mRNA熒光定量PCR試劑盒由浙大生科公司提供。引物:CEA mRNA上游引物序列:5＇-TAG CTA CTT ACT ACT TAC TAC TCC T-3＇，下游引物序列:5＇-CTT TTG TCC CGG CAC ATC GGG C-3＇，探針序列:5＇-TGT ATC GGG ACG TGC ACA AAG ACA G-3＇;CK19 mRNA 上游引物序列:5＇-GGA GAC GCC GGT GGA GTA TCG-3＇，下游引物序列:5＇-CAG GAA CAC GTT GCA CGA TAG-3＇，探針序列:5＇-CCG ATG GGG ATT TAT ACT A-3＇;CK20 mRNA 上游引物序列:5＇-CAT GGA CAT GCT GCA CTT TAG-3＇，下游引物序列:5＇-GCT CGG CAT CCA GAG TCA GGG-3＇，探針序列:5＇-TAG CTA CTI＇ACT TAC TAC TCC T-3＇。cDNA 合成用 Promega公司逆轉錄試劑(反應緩沖液 0.1 mol DTT，10 mmol dNTP，Rnasin，Oligodt，M-MLV 逆轉錄酶)20 μl，加 2 μl RNA 提取液，37℃ 水浴60 min，95℃ 3 min。PCR擴增50 μl PCR反應體系中，包括5×PCR 緩沖液10 μl，上下游引物各 16 pmol，熒光探針 10 pmol，Taq 酶 3 U，10 mmol/L dNTP 1 μl，cDNA 5 μl，在 Roche 公司Light Cycler PCR儀進行擴增。擴增條件:94℃預變性5 min，94℃10 s，65℃20 s，72℃30 s，共 40 個循環。

1.4 結果判斷 以去離子水稀釋109拷貝/ml標準品，依次稀釋拷貝數為每毫升 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102的標準品溶液，經熒光定量擴增后，由儀器軟件自動繪制標準曲線，根據標準曲線得到各檢測標本的濃度。以濃度＞500拷貝/ml為陽性結果，濃度＜500拷貝/ml為陰性。

1.5 統計學分析 采用SPSS12.0軟件進行t和χ2檢驗。

2 結果

2.1 CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA在肺癌患者外周血中的表達水平和陽性率比較 肺良性病變組CEA mRNA、CK19 mRNA均為陰性，CK20 mRNA陽性1例;健康對照組CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA均為陰性，肺癌組與肺良性病變組和健康對照組比較，上述3項組織特異性mRNA表達水平和陽性率差異顯著(P＜0.01)，肺良性病變組和健康對照組比較，上述3項組織特異性mRNA表達水平差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 不同類型肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達水平和陽性率比較 見表1。

2.3 不同臨床分期肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達水平比較 I～Ⅱ期肺癌患者外周血中有陽性表達，Ⅲ、Ⅳ期CEA mRNA、CK19 mRNA的表達水平顯著高于 I～Ⅱ期(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ期 CEA mRNA、CK19 mRNA、CK20 mRNA的陽性率和表達水平明顯高于 I～Ⅱ期(P＜0.05)。見表 2。

表1 不同類型肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(拷貝/ml，s)

表1 不同類型肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(拷貝/ml，s)

與小細胞肺癌和鱗癌組比較:1)P＜0.05

肺癌類型 n CEA mRNA CK19 mRNA CK20 mRNA陽性〔n(%)〕 水平 陽性〔n(%)〕 水平 陽性〔n(%)〕 水平小細胞肺癌 10 2(20.0)2 466±4 165 3(30.0)10 892±24 657 2(20.0)8 283±15 262腺癌 22 14(63.6)28 607±43 4521) 9(41.0)1) 13 874±29 950 8(36.4)1) 11 866±22 3751)鱗癌 28 10(35.7)1) 8 488±15 3881) 15(53.6)1) 19 583±38 4631) 10(35.7)1) 11 075±20 4801)

表2 不同分期肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(拷貝/ml，s)

表2 不同分期肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(拷貝/ml，s)

與Ⅰ～Ⅱ期比較:1)P＜0.05

肺癌臨床分期 n CEA mRNA CK19 mRNA CK20 mRNA陽性〔n(%)〕 水平 陽性〔n(%)〕 水平 陽性〔n(%)〕 水平Ⅰ ～ Ⅱ期 12 4(33.3)4 708±8 264 4(33.3)3 837±6 817 4(33.3)6 491±8 352Ⅲ期 30 19(63.3)1) 16 598±28 7851) 18(60.0)1) 15 052±2 6981) 13(43.3)1) 8 746±18 9031)Ⅳ期 18 12(66.7)1) 21 567±30 5681) 8(77.8)1) 18 807±21 8281) 8(44.4)1) 12 976±25 9651)

2.4 聯合檢測CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA對診斷肺癌微轉移的敏感性、準確性比較 CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA對肺癌患者有很高的特異性和較好的敏感性，聯合兩項檢測準確性和敏感性明顯提高，聯合三項檢測準確性為88.9%，敏感性為80.0%，見表3。

表3 CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA聯合檢測的意義〔%(n/n)〕

3 討論

近年來，隨著分子生物學技術的發展，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術已被用于檢測實體瘤微轉移細胞中組織特異mRNA的表達。該方法具有很高的敏感度，每105～107個正常有核細胞中含1～10個癌細胞即可檢測出來〔1～4〕。CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA是特異性較高的腫瘤相關抗原，很大一部分肺癌患者可有它們蛋白的表達。單獨檢測某一腫瘤標志物基因存在兩個問題，一是陽性率不高，二是特異性不強，因此本研究采用熒光定量RT-PCR方法對CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA三個組織特異性mRNA進行了聯合檢測。本研究結果提示聯合檢測這3個指標可作為判斷肺癌血源性微轉移的輔助指標。

本實驗結果與Peck等〔5〕相似，提示Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者可能已有血源性微轉移。對這部分患者首選除手術外是否加用手術期化療，但尚需選擇更多的I～Ⅱ期患者來長期跟蹤觀察。隨病情發展腫瘤細胞發生血行轉移的可能性更大。部分Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者這3個指標出現陰性的原因可能性有:(1)形成定植性轉移灶后，血循環中腫瘤細胞數量反而減少。(2)腫瘤細胞釋放入血的時間不同，單點檢測可產生偏倚、有條件可多次抽血檢測。(3)該方法的檢測敏感性有待于進一步提高〔6〕。

綜上，應用熒光定量RT-PCR檢測肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA是反映腫瘤細胞血源性播散較靈敏的指標。聯合二至三項指標能提高肺癌微轉移檢測的敏感性和準確性。當然，血循環中癌細胞的存在最終能否發展為腫瘤還受機體免疫及其他因素的調控，為此需擴大樣本量進行長期隨訪。

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2 李招云，朱珊珊，戴岳楚，等.結腸癌患者外周血CEAmRNA RT-PCR檢測的意義〔J〕.臨床檢驗雜志，2005;23(1):41-2.

3 Braun S，Pantel K.Micrometastatic bone marrow involvement:detection and prognostic significance〔J〕.Med Oncol，2005;174(1):154-65.

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5 Peck K，Sher YP，Shih JY，et al.Detection and quantitation of circulating cancer cells in the peripheral blood of cancer peripheral lung patients〔J〕.Cancer Res，2004;52(10):2761-4.

6 Wharton RQ，Jonas SK，Glover C，et al.Increased detection of circulating tumor cells in the blood of colorectal carcinoma patients using two reverse transcription PCR assays and multiple blood samples〔J〕.Clin Cancer Res，2006;13(6):4158-63.