中藥清毒栓對宮頸癌Hela細胞的抑制作用

王艷萍 錢 鑫 田 林 金 哲 (北京中醫藥大學，北京 0009)

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，而且近年來有年輕化的趨勢〔1〕。宮頸癌的發生和患者雜亂、過早、過多的性生活以及缺乏良好的衛生習慣有關，但感染人類乳頭狀瘤病毒(HPV)是導致宮頸癌的最主要原因，目前部分學者認為感染皰疹病毒型也能引起宮頸癌，但是該觀點沒有確定〔2，3〕。西醫治療主要是手術、放療、化療及新輔助化療的方法〔4〕，易造成機體免疫功能下降，甚至出現并發癥而導致死亡。現代醫學認為辨證治療宮頸癌，通過整體觀念，把人體有機地結合起來，調整人體的抗病能力，是治療腫瘤的重要環節。本文旨在研究中藥制劑清毒栓對Hela細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人宮頸癌Hela細胞購自中國科學院上海生命科學院。

1.1.2 藥物 中藥清毒栓由北京中醫藥大學東方醫院金哲教授惠贈;保婦康栓海南碧凱藥業有限公司。批號:Z4602258

1.1.3 主要試劑與儀器 DMEM全培養液購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司;胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，胰酶及乙二胺四乙酸(EDTA):購于 SERVA公司及賽多利斯公司;CCK-8試劑盒，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)均由(碧云天生物技術研究所);熒光顯微鏡 NiKon ECLIPSE，二氧化碳培養箱，均由(日本三樣電機株式會社制造);AN YANG超凈臺(蘇州安洋科技發展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 中藥清毒栓及保婦康栓提純 將兩種中藥分別溶于10 ml水中，將溶液倒入分液漏斗中，分別加入三氯甲烷10 ml，溶液分為兩層，上層為水和蠟質層，下層為氯仿和中藥的有效成分層，將下層置入約80℃水浴箱中蒸發，剩余物質為中藥有效成分，放入4℃中保存待用。

1.2.2 CCK-8法檢測中藥清毒栓對Hela細胞增殖的影響 取對數生長期的 Hela細胞，加入 0.25%胰酶消化，離心1 500 r/min 5 min，細胞計數，調整細胞懸液為 1×104/ml，接種于96孔板(100 μl/孔)，將培養板置入5%CO2培養箱孵育，細胞貼壁后，每孔分別加入 0.022 g/ml，0.011 g/ml，0.005 5 g/ml濃度的中藥清毒栓;保婦康栓濃度為0.035 g/ml，各加入15 μl/孔，設5個復孔，終體積為200 μl，隨機分為空白對照組，清毒栓高、中、低劑量組及保婦康栓組，置入5%CO2培養箱孵育，觀察在24 h時中藥清毒栓及保婦康栓對宮頸癌Hela細胞的作用。在實驗各時間點加入20 μl CCK-8試劑，混勻。在酶標儀上測定各孔吸光值(OD)〔5〕，波長492 nm，記錄結果。

1.2.3 線粒體膜電位法檢測中藥清毒栓對Hela細胞凋亡的作用 取對數生長期的 Hela細胞，加入0.25%胰酶消化，離心1 500 r/min，5 min。細胞計數，接種于六孔板(4.5×105/孔)，待細胞貼壁，隨機分為空白對照組，清毒栓高、中、低劑量組及保婦康栓組，每孔加入不同濃度的清毒栓;濃度同1.2.2中，加入250 μl/孔，終體積為2 ml，設2個復孔，置入5%CO2培養箱孵育24 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞1次，加入1 ml細胞培養液。同時加入1 ml線粒體膜電位檢測試劑(JC-1)染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，將配置好的JC-1染色緩沖液(1X)放置于冰浴。37℃孵育結束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次。加入2 ml細胞培養液。熒光顯微鏡下觀察，激發波長為490 nm，發射波長530 nm，拍照。每個視野計數100個細胞中所含的程序性死亡細胞數，取其均數計算細胞程序性死亡率。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計學分析軟件對數據進行統計分析。計量資料以s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測中藥清毒栓對Hela細胞增殖作用的影響不同濃度的清毒栓對宮頸癌Hela細胞具有一定的抑制作用，并在24 h時作用最為明顯。清毒栓高劑量組(0.920±0.055)與保婦康栓組(0.737±0.038)、空白對照組(1.387±0.036)及清毒栓中、低劑量組(1.249±0.065)、(1.307±0.034)比較具有顯著性差異(P＜0.05)。見圖1。

2.2 線粒體膜電位法檢測中藥清毒栓對Hela細胞凋亡的作用 不同濃度的清毒栓對宮頸癌Hela細胞膜電位引起不同程度的下降，在24 h時作用最為明顯。保婦康栓組〔(56.16±0.096)%〕與空白組〔(22.52±0.062)%〕比較差異有統計學意義(P＜0.05)。Hela活細胞數量明顯減少，清毒栓高劑量組〔(55.74±0.096)%〕與 清 毒 栓 中、低 劑 量 組 〔(37.90±0.069)%、(34.74±0.078)%〕比較具有顯著性差異(P＜0.05)。熒光顯微鏡下可見，正常對照組細胞狀態良好，呈橘紅色熒光，胞漿著色深，可見少量凋亡細胞，高劑量清毒栓組可見許多綠色熒光，少許橘紅色熒光。見圖2。

圖1 各組宮頸癌Hela細胞鏡下一次性給藥(×20)

圖2 各組Hela細胞線粒體膜電位鏡下一次性給藥(×20)

3 討論

研究表明，腫瘤的發生與細胞增殖、細胞凋亡有著密切的關系，細胞凋亡在維持多細胞生物機體穩態、生長發育等生命活動中發揮重要作用〔6〕。

清毒栓為多年臨床用藥，主要成分為莪術、紫草、黃柏等，治療以辨病為主，抓住“毒邪結聚”這一病機關鍵，治法以攻毒散結，選用莪術破瘀消癥，其中莪術主要活性成分為B-欖香烯和莪術醇。其抗腫瘤的主要機制通過直接細胞毒作用，誘導腫瘤細胞發生凋亡〔7〕。紫草以涼血解讀，活血散瘀，作為傳統中藥，其化學成分復雜，具有廣泛的藥理作用，抗腫瘤作用是其中之一。紫草提取物能抑制多種腫瘤細胞生長增殖，導致腫瘤細胞凋亡〔8〕。黃柏清熱燥濕，解讀消腫;黃柏具有抗病毒，提高免疫功能的功效。

本實驗采用CCK-8檢測法，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性橙黃色的甲臜產物。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在492 nm波長處測定OD值，間接反映活細胞數量。CCK-8檢測法是一種綜合指標較好的細胞活性檢測試劑，利用CCK-8試劑檢測細胞活性的方法〔9〕，增加實驗的可信度。結果表明中藥清毒栓可明顯抑制宮頸癌Hela細胞增殖，其中以高劑量抑制細胞增殖的作用比較明顯。

本研究采用線粒體膜電位檢測法，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。結果顯示，在熒光顯微鏡下可現明顯的熒光反應，Hela細胞經JC-1染色后僅呈現橘紅色熒光，若出現早期凋亡的Hela細胞會發出綠色熒光。線粒體膜電位測定結果表明中藥清毒可能通過降低線粒體膜電位抑制腫瘤細胞的增殖和促進其凋亡從而發揮其抗腫瘤作用。本研究結果為中藥清毒栓對宮頸癌的防治提供了一定的實驗基礎，為更深步的探討抗腫瘤機制提供了新的理論依據。

1 單玉珍，馬向東，王 建.人乳頭瘤病毒與宮頸癌研究進展〔J〕.中國臨床研究，2012;25(4):313-5，318.

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3 Sandri MT，Lentati P，Benini E，et al.Compari-son of the Digene HC2 assay and the Roche AMPLICOR human papillsmariras(HPV)test for detection of hig-risk HPV genotypes in cervical samples〔J〕.J Clin Microbiol，2006;44(16):2141-6.

4 王紹光.婦科惡性腫瘤動脈化療的種類、途徑和方式〔J〕.實用婦產科雜志，2006;22(8):453-5.

5 張雪寶，陸天才，張 超.宮頸原位癌中Ki-67的表達及其與細胞凋亡的關系〔J〕.診斷病理學雜志，2004;11(6):418-21.

6 高 超，華子春.細胞凋亡檢測方法新進展〔J〕.中國細胞生物學學報，2011;33(5):564-9.

7 宋利瓊，張昌菊.莪術油聯合干擾素對小鼠宮頸癌端粒酶活性和細胞凋亡的影響〔J〕.上海中醫藥雜志，2006;40(7):68-9.

8 楊 宏，伊淑瑩，翟 靜.紫草提取物抗腫瘤的作用機制〔J〕.生命的化學，2013;33(2):49-53.

9 熊建文，肖 化，張鎮西.MTT法和CCK-8法檢測細胞活性之測試條件比較〔J〕.激光生物學報，2007;16(5):559-62.