MicroRNAs、uPA及MMP-3在骨關節炎患者滑膜組織中的表達及相關性

王維山 史晨輝 何仁豪 周圓家 陳安民 郭風勁

(石河子大學醫學院第一附屬醫院骨科，新疆 石河子 832008)

骨關節炎(OA)是嚴重影響中老年人生活質量的疾病之一。目前普遍認為肥胖、年齡、解剖結構異常、關節創傷病史、關節反復磨損和關節的過度使用都是造成OA發病的因素，但其具體病因學仍然不清。關節軟骨的再生能力極差，一旦OA病理過程啟動，將逐漸演變為以關節功能障礙為代價的關節疾患。在關節軟骨組織降解中，蛋白降解酶發揮至關重要的作用，尤其是以尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)為代表的絲氨酸蛋白降解酶系和以基質金屬蛋白酶3(MMP-3)為代表的基質金屬蛋白酶系作用最明顯〔1～3〕。近年來越來越多的證據顯示microRNAs在OA的病變過程中具有關鍵性的調控作用〔4～6〕。miR-27a通過調控靶基因uPA、miR-140通過調控靶基因MMP-3的表達參與關節軟骨組織的退變過程。本研究通過檢測OA患者關節滑膜組織中 miRNA-140、miRNA-27a、uPA和 MMP-3的表達情況，探討它們之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 所有病例均選取2011年11月至2012年4月就診于石河子大學醫學院第一附屬醫院的住院患者，符合中華醫學會骨科學分會2007年頒布的骨關節炎診治指南中OA的診斷標準〔7〕，并經關節鏡術中證實軟骨退變。OA組33例，男15例，女18例，年齡43～78歲，平均65.2歲，病程8個月～22年，平均10.7年。排除標準:2個月內服用皮質激素類藥物者;患有肝腎功能異常、惡性腫瘤、感染性疾病者;抗“O”、類風濕因子陽性、血沉、C反應蛋白異常者以及妊娠和哺乳期婦女。對照組均來自因外傷行截肢的膝關節和單純膝外傷行關節鏡探查者，入選28例，男13例，女15例，年齡28～66歲，平均51.3歲。術中獲取標本后立即植入液氮中-80℃保存。本實驗得到石河子大學醫學倫理委員會的支持，所有患者均自愿簽定知情同意書。

1.2 試劑 miRNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、Trizol試劑、Real-time PCR試劑盒引物、膠回收純化試劑盒均購自美國ABI公司;引物 miRNA-140、miRNA-27a、uPA、MMP-3及內參 U6由美國ABI公司合成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 將標本約100 mg放于研缽中，加入液氮后迅速研碎，在無酶EP管中按mirVanaTMmiRNA Isolation Kit中的提取步驟提取總RNA，使用超微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。

1.3.2 反轉錄合成cDNA 按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit的操作說明將總RNA濃度稀釋為1～10 ng，配備試劑盒中的混合液7 μl/份，與5 μl RNA 樣本、3 μl引物及內參U6形成15 μl的反應體系，反應條件為:16℃ 30 min，42℃30 min，85℃ 5 min。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測 按照反應體系配置說明配備總反應液20 μl，其中 TaqMan?2 ×Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG?10 μl;Nuclease-free water 7.76 μl;Product from RT reaction 1.33 μl;Custom TaqMan?Small RNA Assay(20 × )1 μl，每個樣本設 3 個復孔，反應條件為:95℃ 10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，共40個循環。應用ABI Prism 7700 system 提供的分析軟件Rotor-Gene real-time PCR analysis software進行分析?！鰿t=CtmiRNA-CtU6，以2-△△CT表示每個miRNA的相對表達量，經過對數換算后作為統計分析數據。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行分析，數據用s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，各指標間相關性采用Pearson分析。

2 結果

2.1 滑膜組織中miRNA表達水平 實時熒光定量PCR檢測33例OA患者和28例非OA患者滑膜組織中miRNA-27a、miRNA-140、uPA mRNA和MMP-3 mRNA的表達擴增曲線良好，擴增效率高。其中miRNA-27a和miRNA-140在OA組中表達水平(1.63 ±0.93、0.94 ± 0.60)顯著低于對照組(3.34±1.68、2.55 ±1.12)，差異有統計學意義(t=-4.121、t=-5.934，P ＜0.001);其中 uPA mRNA 和 MMP-3 mRNA 在 OA組中表達水平(3.52 ±1.79、4.91 ± 1.86)顯著高于對照組(1.16 ±0.65、0.84 ± 0.57)，差異有統計學意義(t=5.284、t=8.881，P ＜0.001)。

2.2 滑膜組織中miRNA表達的相關關系 OA組內miR-27a和uPA呈顯著相關，相關系數為r=-0.699(P ＜0.01)，miR-140和MMP-3呈顯著相關，相關系數為r=-0.598(P＜0.01);uPA和MMP-3之間也有相關性，相關系數為r=0.444(P＜0.05)。對照組uPA和MMP-3之間也呈相關性，相關系數為r=0.652(P＜0.01)，其他各指標相互之間均無相關關系。見圖1。

表1 兩組滑膜組織中miRNA-140、miRNA-27a、uPA、MMP-3之間的相關關系

圖1 MMP-3/miRNA-140、uPA/miRNA-27a、uPA/MMP-3之間的相關關系

3 討論

OA最基本的病理變化特征是軟骨下骨代謝異常及軟骨組織細胞外基質的降解，從而出現軟骨組織的退變，繼發出現關節周圍結構的病理改變，最終導致關節功能障礙。目前對OA病因學及治療研究的側重點在軟骨下骨的代謝改變及關節軟骨的病理性損傷，其中蛋白降解酶的作用已成為眾多學者公認的最基本也最為關鍵的OA病理機制，在眾多降解酶系中，uPA和MMP-3的作用最為突出。已有的多方面文獻〔8，9〕證實，uPA在軟骨退變中發揮著始動因子的作用，是整個MMPs激活途徑的關鍵分子。敲除uPA基因的小鼠行蛋白誘導性關節炎模型〔10〕，結果顯示關節炎病變程度明顯滯后，且軟骨程度顯著低于野生型小鼠。應用uPA抑制劑后發現〔11〕，通過外源性uPA誘導軟骨退變模型只有不到一半的成功率，而未使用抑制劑的動物均發生了軟骨退變。我們前期通過向兔關節注射外源性uPA發現，其可快速誘導軟骨降解過程，周期明顯短于其他蛋白酶的作用過程〔12〕。由于uPA主要作用底物為Pro-MMP-3，因此其在OA病變過程中可能與MMP-3的關系更加密切。我們前期的研究〔13，14〕顯示:在OA滑膜襯里層、滑膜下層細胞中uPA/uPA mRNA大量表達，其表達水平與關節退變呈正相關。在OA關節液中，MMP-3表達顯著高于正常對照組，也間接說明uPA和MMP-3在OA病變中的重要作用。

近年來隨著非編碼RNA的深入廣泛研究，越來越多的證據表明microRNAs在OA軟骨下骨及軟骨組織的生理病理代謝過程中發揮至關重要的調控作用，多位學者通過RT-PCR等技術檢測了OA患者及健康者軟骨組織、滑膜組織及關節液中microRNAs表達的差異，結果顯示具有差異表達的microRNAs較多，通過驗證 microRNAs功能顯示，miR-146a、miR-140、miR-455、miR-9和 miR-27a等均參與了 OA軟骨退變過程的調控〔15～18〕。Akhtar等〔19〕研究顯示，miR-27b 通過上調 MMP13 表達促進軟骨組織的快速退變;另外，miRNA-140可以引起關節滑膜組織中IL-1β的大量表達，進而參與軟骨的降解過程〔20〕。

以上研究提示microRNAs、MMPs和uPA在OA軟骨、滑膜病變過程中發揮著重要的調控作用，但他們之間的相互作用關系尚未見文獻報道。本研究結果表明miR-27a、miR-140、uPA和MMP-3在OA病理變化中起著重要的作用，并且相互之間存在某種調控關系。軟骨細胞在刺激因素的作用下產生miR-140，調控Pro-MMP-3表達;產生 miR-27a調控 uPA表達;Pro-MMP-3在uPA磷酸化后變為有活性的MMP-3，Pro-MMP-13在MT-MMP的作用下變為活性MMP-13，MMP-3和MMP-13又可激活由軟骨細胞和滑膜細胞分泌的Pro-MMP-9轉變為活性的MMP-9，活性MMPs共同作用導致軟骨組織降解。

1 Bian Q，Wang YJ，Liu SF，et al.Osteoarthritis:genetic factors，animal models，mechanisms，and therapies〔J〕.Front Biosci(Elite Ed)，2012;4:74-100.

2 Knapinska A，Fields GB.Chemical biology for understanding matrix metalloproteinase function〔J〕.Chembiochem，2012;13(14):2002-20.

3 Wang X，Li KF，Adams E，et al.Matrix metalloproteinase inhibitors:a review on bioanalytical methods，pharmacokinetics and metabolism〔J〕.Curr Drug Metab，2011;12(4):395-410.

4 Zhang L，Yang M，Marks P，et al.Serum non-coding RNAs as biomarkers for osteoarthritis progression after ACL injury〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2012;20(12):1631-7.

5 Díaz-Prado S，Cicione C，Muióos-López E，et al.Characterization of microRNA expression profiles in normal and osteoarthritic human chondrocytes〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2012;12(13):144-7.

6 Le LT，Swingler TE，Clark IM.The role of MicroRNAs in osteoarthritis and chondrogenesis〔J〕.Arthritis Rheum，2013;65(8):1963-74.

7 中華醫學會骨科學分會.骨關節炎診治指南(2007年版)〔J〕.中華骨科雜志，2007;10(10):793-6.

8 van Wart HE，Birkedal HH.The cysteine switch:a principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1990;87(14):5578-82.

9 Busso N，Peclat V，So A，et al.Plasminogen activation in synovial tissues:differences between normal，osteoarthritis，and rheumatoid arthritis joints〔J〕.Ann Rheum Dis，1997;56(9):550-7.

10 Li J，Ny A，Leonardsson G，et al.The plasminogen activator/plasmin system is essential for development of the joint inflammatory phase of collagen type Ⅱ induced arthritis〔J〕.Am J Pathol，2005;166(3):783-92.

11 Jin T，Tarkowski A，Carmeliet P，et al.Urokinase，a constitutive component of the inffamed synovial fluid，induces arthritis〔J〕.Arthritis Res T-her，2003;5(1):9-17.

12 王維山，史晨輝，周卓浩，等.一側兔膝關節注射外源性尿激酶型纖溶酶原激活物引起雙側膝關節軟骨降解的實驗〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2007;11(19):3738-41.

13 王 鑫，史晨輝，趙 瑾.骨關節炎滑膜組織中uPA、uPAR、PAI-1 mRNA及蛋白的表達及其臨床意義〔J〕.臨床骨科雜志，2009;12(2):217-8.

14 管興發，董金波，王維山，等.骨關節炎患者血清及關節液中TNF-α與MMP-3含量及臨床意義〔J〕.青島醫藥衛生，2008;40(1):9-12.

15 Hong E，Reddi AH.MicroRNAs in chondrogenesis，articular cartilage，and osteoarthritis:implications for tissue engineering〔J〕.Tissue Eng Part B Rev，2012;18(6):445-53.

16 Jones SW，Watkins G，Le GN，et al.The identification of differentially expressed microRNA in osteoarthritic tissue that modulate the production of TNF-alpha and MMP13〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2009;17(4):464-72.

17 Martinez-Sanchez A，Dudek KA，Murphy CL.Regulation of human chondrocyte function through direct inhibition of cartilage master regulator SOX9 by microRNA-145(miRNA-145)〔J〕.J Biol Chem，2012;287(2):916-24.

18 黃澤宇，沈 彬，裴福興.Micro-RNA在骨關節炎中的研究進展〔J〕.中國矯形外科雜志，2012;20(17):1600-3.

19 Akhtar N，Rasheed Z，Ramamurthy S，et al.MicroRNA-27b regulates the expression of matrix metalloproteinase 13 in human osteoarthritis chondrocytes〔J〕.Arthritis Rheum，2010;62(5):1361-71.

20 Araldi E，Schipani E.MicroRNA-140 and the silencing of osteoarthritis〔J〕.Genes Dev，2010;24(11):1075-80.