美洛昔康對慢性鋁過負荷致神經元退變大鼠腦內金屬離子含量的影響

蘇 強 楊俊卿 唐 捷 (南充市中心醫院藥學部，四川 南充 637000)

流行性病學調查研究結果提示，人類攝入鋁的途徑中95%主要來自于食物，而只有不到1%的量來自于空氣中粉塵鋁〔1〕。長期飲用含鋁濃度較高的水，AD 發病率明顯升高〔2〕。長期接觸大劑量的鋁可造成機體多個組織器官損害，并引起嚴重的CNS毒性，表現為行為認知功能障礙、中樞神經元損傷乃至神經元退行性變，但其機制仍未徹底闡明。通過腦室給鋁，可使鋁異常沉積于腦皮層各區以及海馬，導致動物學習記憶功能的損害和神經元退變〔3〕，但此腦損傷應為急性損傷;同時腦室給鋁方式與臨床鋁經口攝入途徑有很大差異，屬于有創性模型，因而有學者認為其還不能稱為嚴格意義上的神經元退變模型。因此，在本研究中采用大鼠長期灌胃給予鋁鹽的方法建立神經元退變動物模型，并以此模型研究美洛昔康對慢性鋁過負荷致神經元退變大鼠腦內金屬離子含量的影響，期望從另一個視角探討慢性鋁過負荷致大鼠神經元退變與腦內金屬離子的關系。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑 清潔級雄性Wistar大鼠40只，質量220～250 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證書號SCXK(渝)20020003。六水三氯化鋁(國產分析純)，葡萄糖酸鈉(國產分析純)，等離子體原子發射光譜檢測(解放軍后勤工程學院進行)。

1.2 方法

1.2.1 慢性鋁過負荷致神經元退變大鼠模型的建立 實驗動物在實驗條件下飼養3 d以適應實驗環境。將實驗動物分為4組，每組10只大鼠，即正常對照組、慢性鋁過負荷模型組、美洛昔康3 mg/kg組和美洛昔康1 mg/kg組。稱取17.9 g AlCl3·6 H2O及9.9 g葡萄糖酸鈉溶于一定量雙蒸水中，待溶液清澈后用0.1 mol/L NaOH將溶液滴定到pH 6.0左右，用雙蒸水定容至100 ml，配制成含Al3+20 g/L的葡萄糖酸鋁溶液，慢性鋁過負荷模型組大鼠灌胃給予葡萄糖酸鋁(Al3+200 mg·kg-1·d-1)，每周5 d，連續20 w;正常對照組大鼠灌胃給予與藥物等體積的0.3%羧甲基纖維素鈉;美洛昔康1、3 mg/kg組在每次給予鋁鹽后30 min灌胃給予，每周灌胃5 d，連續20 w，灌胃體積為10 ml/kg。所有動物有關的實驗與操作均在學校道德與倫理委員會的指導和許可下進行。在20 w模型制備過程中，鋁鹽毒性造成部分大鼠死亡。

1.2.2 金屬離子測定 取-80℃冰箱保存的大鼠腦組織稱重，加入2 ml雙蒸水，勻漿，按8 ml/g腦濕重加入25%四乙基氫氧化銨溶液，80℃消化24 h至溶液澄清，加雙蒸水定容到10 ml，測定時用雙蒸水稀釋5倍。為了避免金屬離子的干擾，所有過程均采用一次性塑料試管。金屬離子含量采用等離子體原子發射光譜分光光度儀測定，用內標法直接測定，測定波長分 別 為:鋁 309.3 nm，鐵 238.2 nm，銅 224.7 nm，鋅206.2 nm。

2 結果

慢性鋁過負荷模型組中金屬離子含量(鋁、鐵、銅、鋅)明顯高于正常對照組，與模型組相比，美洛昔康給予能明顯降低大鼠海馬中金屬離子含量，與美洛昔康1 mg/kg組相比，美洛昔康3 mg/kg組大鼠海馬中金屬離子含量降低更為明顯，差異有統計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。見表1。

表1 美洛昔康對慢性鋁過負荷大鼠腦組織金屬離子含量的影響( s，n=3)

表1 美洛昔康對慢性鋁過負荷大鼠腦組織金屬離子含量的影響( s，n=3)

與對照組比較:1)P ＜0.05;與模型組比較:2)P ＜0.05，3)P ＜0.01;與美洛昔康小劑量組比較:4)P ＜0.05

組別 鋁(μg/g)鐵(μg/g)銅(μg/g)鋅(μg/g)21.53 ±2.90 31.09 ±1.87 3.37 ±0.99 3.92 ±0.73鋁鹽模型組 61.17 ±9.251) 88.97 ±13.981) 10.09 ±0.921) 9.77 ±0.941)美洛昔康大劑量組 41.68 ±1.152)4) 43.32 ±2.852)4) 6.42 ±0.883) 6.37 ±0.453)4)美洛昔康小劑量組 46.46 ±2.242) 56.57 ±4.502) 7.65 ±0.452) 7.39 ±0.252)空白對照組

3 討論

眾所周知鋁具有明顯的神經毒性，鑒于鋁中毒涉及學習記憶障礙和有文獻報道AD患者腦內鐵代謝失衡〔4〕，人們推測鋁的神經毒作用可能與影響腦鐵的代謝有關，但這種關系缺乏有力的直接證據。

在本實驗研究中，筆者采用長期灌胃給鋁的方法建立了神經元退變大鼠模型，結果發現與正常對照組大鼠相比，慢性鋁過負荷大鼠空間學習記憶能力明顯損害，同時，大鼠兩側海馬出現明顯的核固縮，細胞層次明顯減少，這與腦室給予鋁鹽、一氧化碳中毒等致腦損傷的海馬形態學改變特點相似〔5〕。結合大鼠行為學、病理學變化，筆者認為本研究中長期灌胃給予葡萄糖酸鋁，可以導致大鼠神經元退變，而與腦室給鋁模型相比，更能模擬臨床攝入鋁致人神經毒性的方式。

研究發現鋁過負荷致神經元退變與腦內金屬離子水平關系非常密切。鐵是機體必需的一種重要微量元素，但是過量的鐵可通過Fenton反應生成具有大量毒性極大的羥自由基，引發氧化應激反應，最終誘發神經元退行性變〔6〕。其他金屬離子如銅、鋅是腦內一些抗氧化性酶重要組成部分，如Cu-ZnSOD。何百成等〔7〕研究發現腦室給鋁導致急性腦損傷，小鼠腦組織鐵、銅、鋅水平明顯增加。羅映等〔8〕等研究發現鋁過負荷可致小鼠腦組織Cu-ZnSOD活性先升高后下降，并認為鋁過負荷引起腦氧化應激反應，抗氧化應激物質如Cu-ZnSOD表達增加，但是SOD基因長期受到自由基攻擊而出現突變，造成抗氧化應激的酶功能下降，最終導致機體抗氧化應激系統失衡，加重損傷。

與上述研究結果相似，筆者的研究發現與空白對照組相比，模型組海馬組織中金屬離子鋁、鐵、銅、鋅水平明顯增加;給予美洛昔康在阻遏鋁過負荷大鼠腦組織金屬離子水平的增加。關于美洛昔康阻遏金屬離子含量增加的機制，目前尚未完全揭示，有研究發現，前列腺素以及白三烯可促進血腦屏障的開放，從而加重腦缺血損傷〔9〕，通過筆者前期研究發現神經元退變能夠明顯誘導大鼠海馬COX-2 mRNA和蛋白表達增加〔10〕，增加前列腺素的產生，從而開放血腦屏障，大量金屬離子進入腦內，使得腦內金屬離子含量明顯增加;而美洛昔康作為COX-2選擇性抑制劑，能夠抑制COX-2 mRNA和蛋白表達，減少前列腺素的產生，重新關閉血腦屏障，因而使得進入腦內的金屬離子含量明顯降低。筆者的研究還發現，在腦內鐵、鋁離子含量明顯高于其他金屬離子，而以鐵離子含量最高，這可能由于造模本身灌胃給予大量鋁離子，使得大量鋁離子在腦組織沉積，而鋁通過影響鐵調節蛋白2使細胞鐵蛋白表達明顯降低，最后致使鐵水平顯著升高〔11〕。

總之，美洛昔康對慢性鋁過負荷致神經元退變大鼠腦內金屬離子含量升高有明顯的抑制作用。

1 Jalil EC，Falcon AG，Cabrera MG，et al.Assessment of the relative contribution of COX-1 and COX-2 isoforms to ischemia induced oxidative damage and neurodegeneration following transient global cerebral ischemia〔J〕.J Neurochem，2003;86(3):545-8.

2 Brenhouse HCS，Chen EY，Emerich DF，et al.Inhibitors of cyclooxygenase-2，but not cyclooxygenase-1 provide structural and functional protection against quinolinic acid-induced neurodegeneration〔J〕.J Pharmacol ExpTher，2003;306(1):218-21.

3 Fattoretti P，Bertoni-Freddari C，Balietti M，et al.The effect of chronic aluminum(III)administration on the nervous system of aged rats:Clues to understand its suggested role in Alzheimer disease〔J〕.J Alzheimer Dis，2002;5(6):437-40.

4 Carpenter DO.Effects of metals on the nervous system of humans and animals〔J〕.int J Occup Med Environ Health，2001;14(3):209-18.

5 Yang JQ，Zhao XH，Zhou QX，et al.Effects of nimodipine and fructose-1，6-diphosphate on cerebral damage in carbon monoxide poisoning mice〔J〕.Chinese Medical Journal，2003;116(12):1911-5.

6 Nappi AJ，Vass E.Iron，metal loenzymes and eytotoxic reactions〔J〕.Cell Mol Biol(Noisy-le-Grand)，2000;46(3):637-47.

7 何百成，滕永真，楊俊卿，等.鋁過負荷致小鼠腦神經元退變與腦鐵代謝失衡的關系〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志，2006;20(1):66-70.

8 羅 映，何百成，徐蜀遠，等.Cu-Zn SOD活力變化與鋁致小鼠神經元退行性變關系.工業衛生與職業病，2007;33(6):349-53.

9 Stanimirovic D，Shapiro A，Wrong J，et al.The induction of ICAM-1 in human cerebromicrovascular endothelial ceils(HCEC)by ischemia-like conditions promotes enhanced neutrophil/HCEC adhesion〔J〕.J Neuroimmunol，1997;76(1-2):193-205.

10 蘇 強，楊俊卿，張 鵬.美洛昔康對慢性鋁超負荷致神經元退變大鼠海馬環氧化酶2表達的影響〔J〕.中國藥理與毒理學，2009;23(1):6-10.

11 Uz T，Pesold C，Longone P.Aging-associated up-regulation of neuronal 5-lipoxygenase expression:putative role in neuronal vulnerability〔J〕.FASEB J，1998;12(6):439-49.