姜黃素脂質體的研究進展

牛靜，鄒立強，劉偉*，劉珍，劉瑋琳，周偉，曹燕林，彭盛峰

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

姜黃素是從姜黃根莖中提取出的一種黃色酚類物質，是姜黃的主要有效成分之一[1]。近年來由于其低毒性及廣譜的生物學和藥理學活性如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等，已引起越來越多學者的興趣[2]。盡管姜黃素在治療和預防人類疾病方面具有很好的療效性和安全性，但其較低的生物利用率卻極大限制了姜黃素的應用[3]。口服姜黃素后大部分在胃腸道內經過快速代謝生成還原產物后隨糞便和尿液排出體外[4]。姜黃素在水中的低溶解度以及在胃腸液的不穩定性，導致姜黃素生物利用率極低[5]。

研究合適的劑型是提高姜黃素生物利用性的重要途徑之一。目前姜黃素制劑如微膠囊、膠束、包結絡合物、乳劑等均已有報道：如Alfeu Z F[6]等研究表明姜黃素納米膠囊能更有效降低腫瘤尺寸和惡性腫瘤數量。Liu L[7]等研究表明姜黃素膠束能有效的誘導細胞凋亡，減少微血管生成和細胞增殖。Yallapu M M[8]等報道姜黃素環糊精包結絡合物能增強DU145癌細胞對姜黃素的攝入量，從而更加有效的抑制前列腺癌細胞增殖。Aditya N P[9]等研究表明姜黃素納米乳劑能有效抑制前列腺癌細胞的生長，緩釋效果明顯。

脂質體是由磷脂和膽固醇組成的一種類似生物膜的雙分子層結構的藥物載體[1]。脂質體包封能顯著改善姜黃素的多種藥理活性。脂質體生物相容性較高，容易制備，包封范圍較廣，可以包封親水性、親脂性以及兩親性物質[10]。脂質體能解決脂溶性藥物不溶于水的難題，提高易氧化藥物在體內外的穩定性，降低被包封藥物的毒性，具有靶向性、緩釋性，有效增加藥物被腫瘤細胞的攝取量。姜黃素脂溶性好，其脂質體包封率高，因此以脂質體作為姜黃素的載體具有明顯的優勢[1]。以下對目前姜黃素脂質體的制備技術、質量評價及其生理特性等的研究概況作了綜述。

1 姜黃素脂質體的制備工藝

脂質體包封按載藥性質可分為被動載藥和主動載藥。其中被動載藥又包括薄膜法、凍融法、逆相蒸發法、有機溶劑注入法、復乳法等。主動載藥主要包括pH值梯度法和硫酸銨梯度法等。目前用于制備姜黃素脂質體的方法主要有以下幾種：

1.1 薄膜分散法

該法是先將類脂質等溶解于有機溶劑，然后減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，待形成一層薄膜后，加入水相介質洗膜形成較為均勻的懸濁液即為脂質體。該法操作簡單，無需特殊設備，但藥物包封率低，重復性差，不適合大批量生產。如Chen Y[11]等采用薄膜法制備姜黃素脂質體，并研究了其抗黑色素瘤的活性。Lin Y L[12]等用薄膜法制備姜黃素脂質體，并用聚乙二醇、聚乙烯亞胺進行修飾。

1.2 有機溶劑注入法

將溶有類脂質的有機相，用注射器緩慢均速注射到恒溫且在有機溶劑沸點以上的水相介質中，繼續攪拌揮盡有機溶劑即得脂質體。該法因操作過程中使用高溫和有機溶劑，會引起熱敏性物質的滅活以及大分子物質的變性，且對水溶性物質的包封率偏低，粒徑較大。如 Patra D[13]等用乙醇注入法制備姜黃素脂質體，并研究姜黃素及姜黃素脂質體與膽鹽之間的相互作用。Saujanya L[14]等分別用乙醇注入、薄膜分散和超聲三種方法制備姜黃素脂質體，其中乙醇注入法所得脂質體包封率相對較低且緩釋性不如后兩者。

1.3 凍融法

前期處理與薄膜分散法類似，得到懸液后反復幾次凍融操作，在快速冷凍過程中冰的形成使脂質體膜破裂，此時冰的片層與破裂的膜同時存在，該狀態不穩定，在緩慢融化過程中暴露的脂質膜相融合，重新形成脂質體。該法可形成包封率較高、穩定性較好的脂質體，但制備耗時長、成本高。如Wang D[15]等用凍干法制備姜黃素脂質體，并研究其對頭頸部鱗狀細胞癌細胞株CAL27和UM-SCC1的抑制作用。Li L[16]等用凍干法制備姜黃素脂質體，能有效抑制腫瘤新生血管的生成和誘導人類胰腺癌細胞凋亡。

1.4 復合法

為形成顆粒小而均勻的脂質體，提高脂質體穩定性，在制備出粗脂質體后，通常再通過擠出、超聲或高壓微射流等技術制備納米脂質體。其中用微射流技術制備的脂質體，粒度分布均勻，可以連續化、大批量生產，但完全均質耗時較長。如Takahashi M[17]等采用高壓均質結合微射流法制備姜黃素脂質體并研究了生物利用率。Isacchi B[18]等用薄膜結合動態高壓微射流法制備姜黃素青蒿素復合脂質體，有效增強抗瘧原蟲效率。

2 姜黃素脂質體的質量評價

姜黃素脂質體的質量評價是研究姜黃素脂質體穩定性以及生物利用率的重要指標之一。目前關于脂質體的質量評價指標主要有以下幾方面：

2.1 包封率

包封率為脂質體的重要指標之一，不同的藥物包封率相差較大。一般采用超速離心、透析等分離方法將溶液中游離藥物和脂質體分離，從而計算包封率。如Liu Y L[12]等使用超速離心測得包封率為45%。Agrawal R[19]等用透析分離游離姜黃素，測得包封率為76%。Li C[20]等利用凝膠過濾測得包封率為90.62%。

影響包封率的因素有多種，如緩沖液的pH值：有報道稱在pH=7.2時，90%的姜黃素在30min內降解，但在pH=6.5時可保留高達97%的含量[21]，適當降低緩沖液的pH值能在一定程度上提高包封率；磷脂類型：有研究表明姜黃素對磷脂酰膽堿具有更強的親和力，增大磷脂酰膽堿的比例，會相應提高包封率[22]；制備方法：有報道用薄膜分散和超聲法分別制備姜黃素脂質體，得到多室和小單室脂質體，因親脂性藥物姜黃素存在于磷脂雙分子層中，多室脂質體有多層膜，故包封率高于后者[23]；也有學者先利用環糊精包結姜黃素，再制成脂質體，可有效提高包封率Santosh S D[24]；此外緩沖液濃度以及姜黃素與磷脂雙分子層之間的相互作用[25]等都會不同程度影響包封率。

2.2 粒徑

脂質體粒徑有一定跨度，一般采用掃描電鏡、激光散射法或激光掃描法測定粒徑。如Chen Y[11]等用不同磷脂制備姜黃素脂質體，粒徑分別為 82.37 ± 2.19 、83.13 ± 4.89和 92.42 ± 4.56 nm。Thangapazham R L[26]等制備姜黃素脂質體均粒徑在100–150 nm。Takahashi M[5]等獲得小單室姜黃素脂質體，均粒徑在263nm。

脂質體粒徑大小跟多種因素有關，如制備方法：目前運用于制備姜黃素脂質體的方法主要有薄膜分散、有機溶劑注入、凍融和復合法等。其中凍融法因多次凍融操作，會使粒徑有所增加，薄膜分散和有機溶劑注入法一般制得粗脂質體，粒徑相對較大且分布不均勻，為此可采用復合法，在得到粗脂質體后再通過超聲、擠壓或過微射流等降低脂質體粒徑；脂質體磷脂雙分子層的層數，也會一定程度影響粒徑大小，一般包裹同種藥物時，多室脂質體粒徑要高于單室脂質體。

2.3 電位

采用中性磷脂制備脂質體，電位一般接近中性，在儲藏過程中較易發生聚集，因而出現絮凝甚至是沉淀。為提高脂質體的儲藏穩定性，通常會選擇帶電磷脂或加入十八胺等物質以提高帶電性能。一般認為脂質體的電位絕對值大于30 mV 即比較穩定。如Niu Y M[27]等制備姜黃素脂質體，電位為-48 mV。Liu Y L[12]等制備修飾姜黃素脂質體，電位約40 mV。

影響脂質體電位的因素有多種，如磷脂種類、離子強度、溶液pH值、所包載藥物的種類等。如有研究表明用大豆卵磷脂制備的中鏈脂肪酸脂質體的 Zeta電位絕對值最大，為 37.67mV；且脂質體電位隨磷脂濃度的增大呈現先增大后減小的趨勢；也有報道用陽離子疏水性殼聚糖衍生物修飾姜黃素脂質體，由于陽離子的存在提高了姜黃素脂質體的電位，使脂質體不易發生聚集[28]。

2.4 微觀結構

一般脂質體為規則的球形結構，在受外力擠壓或長期貯存發生氧化、泄露等情況時，脂質體會發生一定程度的形變，如變成橢圓形、形成缺口等，故脂質體的微觀形貌能一定程度上反映其穩定性，是否發生了氧化、泄露等。如Chen Y[11]等研究表明姜黃素脂質體所有囊泡都類似球形或橢圓形，且不同磷脂類型對脂質體囊泡微觀形狀并沒有顯著影響。Lin Y L[12]等用聚乙烯亞安共聚物修飾姜黃素脂質體，觀測到脂質體成球形且表面帶有類似毛發狀的分支，該分支為聚乙烯亞安共聚物。

可用掃描電鏡、冷凍-斷裂電鏡、原子力顯微鏡和透射電鏡等觀察脂質體的微觀結構。其中掃描電鏡只能看到樣品的表面結構，看不到脂質體的內部結構，可用于觀察脂質體表面接的抗體，靶頭等；冷凍-斷裂電鏡可以觀察到脂質體的斷面微觀結構，但價格較貴；原子力顯微鏡不需對樣品進行特殊處理，觀察到的是三維圖像；透射電鏡觀察到的是二維圖象，在看到表面圖象的同時也能看到內層物質，可觀察到脂質體外形是否整圓，如果雙層膜柔性較大，可以看到脂質體的形變，此外透射電鏡還能觀察到脂質體是單室脂質體還是多室脂質體，當然這也和脂質體處方、制備方法等有直接關系。目前較多使用透射電鏡和原子力顯微鏡觀察脂質體的微觀結構。

3 姜黃素脂質體的生理特性

利用脂質體包封姜黃素可提其生理活性，從而改善姜黃素的生物利用率，主要表現在以下方面：

3.1 提高溶解度

姜黃素在水中溶解度極低，堿性條件下迅速分解，利用脂質體包封姜黃素，能有效提高姜黃素在水中的溶解度。這主要是因為磷脂分子的疏水尾部與姜黃素分子之間的疏水相互作用，通過自組裝的方式將姜黃素包埋在內部，保護姜黃素不被降解[29]；脂質體自身的磷脂雙分子層膜的外圍是磷脂的親水頭部，脂質體是水溶性的，保證了姜黃素在水中的含量；腸道pH在7.4左右，姜黃素在腸道中會迅速降解，同時在腸粘膜和血液循環中也會有一定程度的降解，脂質體包裹后，減少了姜黃素與外界環境的接觸，可有效避免姜黃素在腸道中的降解和生物轉化，提高姜黃素在血液和組織中的濃度[30]。如Su D M[29]等報道姜黃素脂質體在PBS中的溶解度是游離姜黃素的5倍。Adina N L[31]等先利用姜黃素與磷脂合成接枝物，進一步制備成納米脂質體，使姜黃素懸掛在脂質體表面，有效提高了姜黃素在水中的溶解度。

3.2 增強穩定性

脂質體包裹后能增強姜黃素的穩定性，可能是包裹后姜黃素分子一頭的苯氧基團鑲嵌在脂質體的親水腔表面，而酮-烯醇基團和另一頭的苯氧基團則包埋在脂質體的疏水層內，有效避免姜黃素酮-烯醇基團與水相介質的接觸[32]；兩個羥基位于雙分子層內部，在一定程度上避免了姜黃素的水解和生物轉化等作用[33]；姜黃素苯氧基團與磷脂親水頭部之間的的氫鍵締合作用也有效抑制了姜黃素的降解[26]；此外，由于脂質體粒徑在納米級別，分散系數較小，使脂質體不易發生聚沉，進一步增強了姜黃素的穩定性[33]。如Chen C G[34]等制備姜黃素脂質體，顯著提高了姜黃素在PBS緩沖液中的穩定性。Niu Y M[27]報道在溫度低于70℃時，脂質體對姜黃素的穩定性具有良好的保護作用。

3.3 提高抗氧化能力

姜黃素通過供氫等作用能抑制ROS生成，清除O2-·和·OH，抑制巨噬細胞誘導NOS活性，但姜黃素較低的水溶性和穩定性導致其抗氧化性受限[35]。姜黃素脂質體清除自由基能力增強可能是因為脂質體的包裹提高了姜黃素的溶解度和穩定性，同時由于脂質體為脂質雙層膜，與生物膜有較好的相容性，從而提高攝取率, 增大了血藥濃度[36]；其次脂質體能改變藥物在體內的分布，延緩藥物的清除率，促進藥物在血液中的循環時間；此外DPPH具有較強的疏水性，自由基清除反應很可能發生在脂質體內部，姜黃素分子的酮烯醇基團及一頭的苯氧基基團深埋在脂質體疏水腔內部，更易提供氫原子[26]。如Niu Y M[27]等報道25℃時姜黃素脂質體清除DPPH自由基的能力是游離姜黃素的1.6倍。Purusotam B[36]等研究表明在抗氧化及抗炎癥方面姜黃素脂質體作用效果是游離姜黃素的2-6倍。

3.4 緩釋

脂質體是一種緩釋制劑，藥物由于脂質體的包埋作用或類脂質與藥物間的疏水相互作用，延緩藥物釋放；一般包裹同種藥物多室脂質體的緩釋性優于單室脂質體，這可能是因為多室脂質體有多層膜，阻止了姜黃素從內層膜向外層膜的運輸作用，能有效截留藥物[23]。脂質體的緩釋作用可降低給藥次數和藥物毒性，提高患者的適應性和藥物療效。如Niu Y M[27]等研究表明姜黃素脂質體在pH=7.0時具有較好的穩定性和緩釋性。Saujanya L G[23]等研究表明姜黃素多室脂質體和單室脂質體在37℃下24h的釋放量分別為20%和30%，這說明多室脂質體的緩釋作用更明顯。

3.5 促進機體吸收

姜黃素脂質體為納米級別，可透過腸上皮細胞表面，通過粘液擴散，細胞運送和胞外分泌等，在胃腸道內可直接被吸收，從而避免了在肝臟內的初級代謝[37]；低水溶性藥物通過表面活性劑乳化后增大了比表面積，可提高在胃腸道內的吸收[38]；脂質體含有乳化劑，可增大姜黃素對胃腸膜的滲透性和溶解性；姜黃素鑲嵌在磷脂雙分子層內，降低了在吸收過程中的酶解作用和暴露在腸道菌群中的程度，有效降低對姜黃素的降解和生物轉化作用[5]；若所得脂質體帶正電，則更有利于增加病變細胞的攫取率，因帶正電的脂質體較易與帶負電的細胞膜發生相互作用，從而促進病變細胞對姜黃素的吸收[28]。如 Takahashi M[5]等報道小鼠口服姜黃素脂質體與單獨服用姜黃素相比，生物利用率提高 4.96倍。Narayanan N K[39]等研究表明脂質體有效提高了姜黃素在血液和組織中的濃度，將姜黃素最大濃度從50ng/ml提高到100ng/ml。LI C[20]等報道用脂質體包封后將姜黃素在血液中的濃度提高了2.35倍。

3.6 抗腫瘤

脂質體可作為抗癌藥物的載體，由于脂質體的靶向性，可使藥物緩慢釋放，并在特定病變部分抑制腫瘤細胞。姜黃素主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖兩種途徑預防腫瘤的發生[40]。可通過調節的細胞信號通路如芳烴受體、解毒酶 、蘇氨酸激酶-PKC 、JNK、AP-1, NF-kB, COX-2 和EGF等受體[41]；或者通過合成途徑中產生活性氧自由基降低JNK 活性，減少神經酰胺生成量，從而誘導腫瘤細胞凋亡的[42]；也可通過調節轉錄因子來抑制COX-2 活性[43]；還可通過抑制與血管生成、轉移相關的細胞信號，延緩致癌作用；此外，姜黃素對基質金屬蛋白酶-9和鋅依賴性肽鏈內切酶的抑制可導致細胞外基質降解，從而預防細胞增殖[44]。如 Orr W S[45]等研究表明姜黃素脂質體能有效抑制神經母細胞瘤NF-k B的活性并可誘導腫瘤細胞凋亡。Thangapazham R L[26]等研究表明37℃培養48h，姜黃素脂質體至少抑制70 ～80%前列腺癌細胞系LNCaP 和C4-2B的增值，而游離姜黃素達到同樣效果則需要10倍劑量。由于所有實體癌生長都依賴于血管發生，姜黃素抑制血管生成作用的發現可以很好的解釋為什么姜黃素能夠阻止不同類型腫瘤生長。如Li L[46]等用聚乙二醇修飾姜黃素脂質體進一步研究表明其具有抗血管生成作用，包括衰減CD31、抑制血管內皮生長因子以及通過免疫組織化學法抑制白介素-8的表達等作用。脂質體能提高姜黃素對腫瘤細胞的抑制作用，可能是磷脂與細胞膜表面的融合促進了藥物向細胞內的運送[47]；磷脂是脂質體的主要成分，具有良好的生物相容性，可提高細胞膜對包埋藥物的通透作用，促進機體對姜黃素的吸收，提高細胞內藥物濃度，提高藥物的抗癌效果[11]；腫瘤脈管系統具有多孔性，加之受損的淋巴流，能增強納米脂質體的滲透率和藥物的保留率[23]；脂質體特有的靶向性，極大促進了姜黃素在特定病灶部位的累積，增加癌細胞對姜黃素的攝入量，這也是脂質體顯著提高姜黃素抗癌效果的重要原因之一。

4 展望

姜黃素具有獨特的藥理作用，在藥物臨床應用方面有很好的療效，也可作為食品著色劑等，但其水溶性和穩定性較差，生物利用率低，限制了其在醫藥、食品等行業的應用，姜黃素脂質體的制備在一定程度上解決了這一難題，具有十分廣泛的應用前景和研究價值。脂質體作為姜黃素藥物載體的應用雖然具備許多優點和特點，但就目前來看也還存在一定的局限性，如：一般的脂質體的靶向性主要集中于肝、脾、腎等網狀內皮細胞豐富的器官，如欲對其它組織器官進行治療，其靶向性不明顯，已有學者制備葉酸配體專一靶向性脂質體，旨在于解決脂質體靶向性不明顯的問題[33]；脂質體在生理狀態下以及儲存過程中的不穩定性，容易導致脂質體的沉淀、氧化、泄露等，對脂質體進行修飾如制備殼聚糖修飾脂質體等可一定程度上提高穩定性[28]；在脂質體制備過程中加入賦形劑如海藻糖、丙二醇等以維持脂質體膜的流動性，且丙二醇等能提高角質脂質層的流動性，增強藥物的熱力學活性，從而提高透皮效率[48]；未來也可向新型脂質體等方向發展，如制備柔性脂質體、熱敏脂質體和長循環脂質體等以提高姜黃素脂質體的經皮滲透效率、攝取量和循環時間等。當然，隨著對姜黃素脂質體研究的不斷深入，姜黃素脂質體的制備工藝將會不斷完善，穩定性也將逐步提高，姜黃素脂質體將會在功能食品甚至藥理學得到越來越廣泛的應用。

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