醋制降低京大戟細胞毒性部位對小鼠肝臟氧化損傷機制研究

曹雨誕，陳海鷹，張 麗，丁安偉

(南京中醫藥大學，江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇南京 210046)

京大戟為大戟科植物大戟(Euphorbia pekinensisRupr.)的干燥根［1］，始載于《神農本草經》，列為下品，為中醫臨床常用的峻下逐水藥。其性寒，味苦，有毒。由于其生品毒性較大，故采用醋制法降低京大戟的毒性，緩和其瀉下作用［2］。本課題組前期實驗已經證實京大戟的細胞毒性部位為石油醚、乙酸乙酯部位［3］，但有關醋制降低京大戟毒性作用的物質基礎和作用機制尚缺乏明確的揭示。因此，本實驗擬采用整體動物模型，通過多次給予小鼠京大戟生品和醋品細胞毒性部位提取物，比較醋制前后對小鼠的肝組織形態和氧化損傷的影響，初步探討醋制降低京大戟對小鼠肝毒性的作用機制，以期為進一步研究京大戟醋制減毒的物質基礎及作用機制提供依據。

1 儀器與材料

1.1 動物 ICR小鼠70只，♀♂各半，體質量18～22 g，購自浙江省實驗動物中心，合格證號:SCXK(浙)2008－0033。

1.2 藥物 京大戟飲片購于安徽省亳州市藥材總公司，經南京中醫藥大學樂巍副教授鑒定為大戟科植物大戟Euphor-bia pekinensisRupr.的塊根。京大戟生品:取凈京大戟飲片2 kg，打粉;京大戟醋品:取凈京大戟飲片2 kg，用米醋600 g悶潤，加水稀釋至3 000 ml，繼續悶潤，文火煮沸至醋吸凈，取出，室溫晾干，40℃減壓干燥，打粉。

將京大戟生品和醋品粗粉(過2號篩)以6倍量乙醇回流提取3次，回收乙醇提取液，得到京大戟生、醋品醇提浸膏(得率分別為13.65%和15.64%)，醇提浸膏用水懸浮，懸浮物依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到京大戟生、醋品石油醚部位和乙酸乙酯部位混合浸膏(得率分別為10.12%和9.01%)。臨用前，用0.5%的CMC-Na溶液和食用油(9∶1)分別配成所需濃度的藥液。

1.3 試劑 谷丙轉氨酶(ALT)測定試劑盒、谷草轉氨酶(AST)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、微量丙二醛(MDA)測定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 TP1020自動脫水機、RM2135型石蠟切片機、DM1000光學顯微鏡(均為德國LEICA公司)，CS-VI型攤片烤片機(湖北孝感宏業醫用儀器有限公司)，Tissue-Tek TEL組織包埋機(日本SAKURA公司)，powerwave X340全波長酶標儀(美國Bio-Tek公司)，AY220電子分析天平(日本島津)，TGL-16M高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組 小鼠按體重隨機分為7組，即空白對照組，京大戟生品細胞毒性部位高、中、低劑量組，京大戟醋品細胞毒性部位高、中、低劑量組，每組10只。實驗動物飼養于室溫、通風的清潔級動物室中，自由攝食飲水，適應性飼養3 d。2.2 劑量設計 按照人臨床用量的6、4、2倍，并結合本課題組前期預試結果，本實驗京大戟生品和醋品高、中、低劑量組分別灌胃給予60、40、20 mg·g－1，空白對照組灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液和食用油(9∶1)，每日兩次，連續灌胃6 d。

2.3 肝功能指標測定 末次給藥后，禁食16 h，不禁水，小鼠稱重，摘眼球取血，待血清析出后，3 500 r·min－1，10 min，分離血清，按照試劑盒說明書，進行ALT、AST、LDH活性的測定。

2.4 肝臟氧化損傷指標測定 稱取0.5 g肝組織，加入預冷的0.9%生理鹽水，冰浴勻漿，制成10%肝組織勻漿，3 500 r·min－1，10 min，吸取上清，用 BCA 法測定蛋白含量，按照試劑盒說明書測定SOD活性、MDA含量、GSH含量。

2.5 統計學處理 實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，各組定量檢測數據以±s表示，組間比較采用LSD檢驗。

Tab 1 Effects of Euphorbia Pekinensis before and after processed with vinegar on the activities of ALT，AST，LDH on liver function and the levels of SOD，GSH and MDA in liver tissue(±s，n=10)

Tab 1 Effects of Euphorbia Pekinensis before and after processed with vinegar on the activities of ALT，AST，LDH on liver function and the levels of SOD，GSH and MDA in liver tissue(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Crude

Group ALT/U·Pro Control 8.182 ±0.377 8.910 ±2.404 11860 ±599 0 L－1 AST/U·L－1 LDH/U·L－1 MDA/μmol·g－1Pro GSH/mg·g－1Pro SOD/U·mg－1.220 ±0.137 0.828 ±0.072 15.25 ±0.245 Crude 20 mg·g－116.16 ±1.267＊＊ 22.24 ±3.036＊＊ 15509 ±1126* 1.284 ±0.351＊＊ 0.326 ±0.064＊＊ 8.371 ±0.919＊＊40 mg·g－120.63 ±0.743＊＊ 31.66 ±2.229＊＊ 18667 ±978＊＊ 1.612 ±0.349＊＊ 0.238 ±0.023＊＊ 4.221 ±0.858＊＊60 mg·g－127.61 ±1.139＊＊ 45.69 ±2.438＊＊ 22456 ±851＊＊ 1.955 ±0.326＊＊ 0.194 ±0.016＊＊ 2.073 ±0.933＊＊Vinegar 20 mg·g－111.97 ±0.911# 12.42 ±1.374# 12982 ±677# 0.635 ±0.145# 0.561 ±0.093# 11.21 ±0.608##40 mg·g－115.70 ±0.569## 20.00 ±2.489## 15053 ±1671# 0.969 ±0.305# 0.408 ±0.040## 8.037 ±1.078##60 mg·g－119.57 ±1.900## 34.44 ±1.124## 19123 ±790## 1.193 ±0.334# 0.322 ±0.014## 3.862 ±0.588##

3 結果

3.1 一般情況觀察 空白對照組小鼠未見明顯異常，京大戟生品和醋品給藥組小鼠均表現出少食、少動、精神不佳、毛發無光澤、下腹腫脹、體重降低等癥狀，并隨給藥劑量增加而癥狀加重。

3.2 京大戟醋制前后對小鼠肝功能的影響 與空白對照組比較，60、40、20 mg·g－1京大戟生品均明顯升高小鼠血清中ALT、AST、LDH活力(P＜0.05)，且呈一定的劑量相關性;與生品各劑量組比較，醋品各濃度組可明顯降低小鼠血清中ALT、AST、LDH活力(P＜0.05)，呈一定的劑量相關性，見Tab 1。

3.3 京大戟醋制前后對小鼠肝臟氧化損傷指標的影響 與空白對照組比較，60、40、20 mg·g－1京大戟生品可明顯降低小鼠肝臟中SOD活性和GSH含量(P＜0.01)，增加小鼠肝臟中MDA含量(P＜0.05)，且呈一定的劑量相關性;與生品各濃度組比較，醋品各劑量組可明顯提高小鼠肝臟中SOD活性和GSH含量(P＜0.01)，降低小鼠肝臟中MDA含量(P＜0.05)，且呈一定的劑量相關性，見Tab 1。

4 討論

中藥致肝毒性損傷時，可使血中ALT、AST活性升高［4］;LDH是一種糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織器官中，LDH的釋放是細胞膜受損的敏感指標之一［5］，因此ALT、AST和LDH可作為評價肝損傷程度的指標［6］。氧化損傷機制是引起肝損傷的主要機制［7］，主要變化為丙二醛(MDA)含量升高，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量下降［8］，因此MDA、SOD和GSH可作為肝毒性氧化損傷程度的指標。

本實驗研究結果顯示，與空白對照組相比，連續6 d給予小鼠不同劑量的京大戟細胞毒性部位后，小鼠血清中ALT、AST和LDH活性明顯增高，且隨給藥劑量增加而增高，呈現一定的“量－毒”關系。小鼠肝臟中SOD活性明顯下降，GSH含量明顯降低，MDA含量明顯增加。該結果提示京大戟細胞毒性部位致小鼠肝損傷途徑可能與氧化損傷有關。

與京大戟生品組相比，連續6 d給予小鼠不同劑量的京大戟醋品細胞毒性部位后，肝功能損傷指標明顯降低，氧化損傷指標減輕，這個結果與前期的京大戟細胞毒性部位對人正常肝細胞LO2毒性研究的結果相符［3］。上述結果提示醋制可明顯降低京大戟肝毒性，其可能機制為通過降低京大戟對肝細胞膜通透性的影響及減輕氧化損傷而實現，這為進一步闡明京大戟醋制減毒的物質基礎及作用機制提供了的一定依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010版，一部:208.

［1］Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People＇s Republic of China［S］.Beijing:China Medical Science Press，2010，VolumeⅠ:208.

［2］邱韻縈，郁紅禮，吳 皓，等.大戟科大戟屬根類中藥的毒性研究進展［J］.中國實驗方劑學，2011，17(23):259－64.

［2］Qiu Y Y，Yu H L，Wu H.Research progress on toxicity of medicinal plants of Euphorbia［J］.Chin J Exp Tradit Med Formul，2011，17(23):259－64.

［3］陳海鷹，曹雨誕，顏曉靜，等.醋制降低京大戟對人正常肝細胞LO2的毒性及機制研究［J］.中國中藥雜志，2013，38(6):866－70.

［3］Chen H Y，Cao Y D，Yan X J，et al.Study on detoxication and mechanism of vinegar-processed Euphorbia pekinensis on normal liver cells LO2［J］.Chin J Chin Mat Med，2013，38(6):866 －70.

［4］孫 蓉，楊 倩，黃 偉，等.肝功能相關指標在中藥肝毒性損傷中作用與毒性相關程度分析［J］.中藥藥理與臨床，2008，24(6):82.

［4］Sun R，Yang Q，Huang W，et al.Analysis of the related indexes of liver function in liver toxicity of traditional Chinese medicine in effect and toxicity of correlation degree［J］.Pharmacol Clin Chin Mat Med，2008，24(6):82.

［5］金惠銘.病理生理學［M］.上海:復旦大學出版社，2005:173.

［5］Jin H M.Pathophysiology［M］.Shanghai:Fudan University Press，2005:173.

［6］俸家富，涂植光.肝功能相關的血清酶學研究進展［J］.醫學綜述，2007，13(3):225－30.

［6］Feng J F，Tu Z G.Progress of serum enzymology related to liver function［J］.Med Recap，2007，13(3):225 －30.

［7］楊惠玲.高級病理生理學［M］.北京:科學出版社，1998:24－30.

［7］Yang H L.Advanced pathophysiology［M］.Beijing:Science Press，1998:24－30.

［8］謝京兒，廖錫麟.藥物性肝損傷機制與脂質過氧化［J］.中國藥理學通報，1990，6(1):7.

［8］Xie J E，Liao X L.Drug induced liver injury and lipid peroxidation［J］.Chin Pharmacol Bull，1990，6(1):7.