PBDC1蛋白的表達及其多克隆抗體的制備

戚武林，胡江江，曹玲玲，趙輔昆，張世馥

(浙江理工大學生命科學學院蛋白質組學與分子酶學研究室，浙江杭州310018)

多糖生物合成域1蛋白(polysaccharide biosynthesis domain-containing 1，PBDC1)含有198個氨基酸，分子質量約為22.2 ku。在丁酸鈉(sodium butyrate，SB)［1－2］誘導小鼠紅白血病(murine erythroleukemia，MEL)細胞［3］分化的差異蛋白質組中，發現了PBDC1蛋白含量在細胞紅系分化過程中逐漸下調。由此推測，PBDC1蛋白可能與誘導的MEL細胞分化有關。鎳柱親和層析的原理是利用蛋白質表面的組氨酸能與Ni2+發生特殊的相互作用，能夠吸附富含組氨酸的蛋白質，從而達到分離純化的目的。本實驗擬通過原核表達系統表達含有6×His標簽的PBDC1融合蛋白，通過鎳離子親和柱純化得到PBDC1融合蛋白，并免疫新西蘭大白兔制備其多克隆抗體，為研究PBDC1蛋白在紅系分化中的功能提供有利工具。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E．coli BL21(DE3)和pET-28a(+)質粒(本研究室保存);MEL細胞(上海生命科學研究院);DMEM培養基和胎牛血清(Gibco公司);質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒(Qiagen公司);DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ和 XhoⅠ(Takara公司);異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、弗氏完全佐劑與不完全佐劑(Sigma公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);反轉錄試劑盒(Fermentas公司);鎳離子親和層析介質(上海生工生物工程公司);其他試劑均為分析純;引物合成、DNA測序(上海桑尼生物科技有限公司);質譜鑒定(本研究室完成);免疫用新西蘭大白兔為普通級，體質量約2.5 kg，雄性，來源于浙江省實驗動物中心［合格證號SCXK(浙)2009-0039］。

1.2 PBDC1基因的獲得

MEL細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養至對數增殖期，收集細胞，提取RNA［4］，反轉錄獲得cDNA。根據PBDC1基因序列，設計上游引物:5'-CGGAATTCATGGATGCTGCCGGCGA-3'(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物:5'-CCGC TCGAGCTACTTTTCTCCTTCTCTGTTGGCTC-3'(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)。以cDNA為模板，PCR擴增PBDC1基因。PCR反應條件為:94℃變性30 s，57 ℃ 退火 30 s，68 ℃ 延伸 1 min，共 30 個循環;再68℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳回收PBDC1基因片段。

1.3 pET-28a(+)-PBDC1表達載體的構建與鑒定

將pET-28a(+)質粒與PBDC1基因分別用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切，將回收的基因片段與載體通過T4 DNA連接酶進行連接。連接產物轉化BL21(DE3)感受態細胞后篩選克隆，對重組質粒進行PCR鑒定、EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定以及測序分析。

1.4 PBDC1蛋白的誘導表達

將篩選到的含陽性克隆的BL21(DE3)菌株接種到4 mL含50 mg/L Kan的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜;再將培養物按1∶100的比例接種至400 mL含Kan的LB培養基中，37℃振蕩培養4 h，使培養液的A600值達到0.5～0.7，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續振蕩培養4 h，最后離心收集菌體。

1.5 PBDC1蛋白的純化

將收集得到的菌體重懸于裂解緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L 咪 唑，pH 8.0)中，冰浴并超聲波破碎后，離心收集上清，上樣于鎳離子親和層析柱，用洗滌緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，40 mmol/L 咪 唑，pH 8.0)洗柱，除去非特異結合的蛋白質，最后用洗脫緩沖 液 (50 mmol/L NaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，100 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脫，收集目的蛋白溶液，并通過SDS-PAGE來檢測純化結果。

1.6 PBDC1多克隆抗體的制備

將純化得到的PBDC1蛋白通過脫鹽、濃縮用于免疫兔，首次免疫500μg蛋白，之后每隔7 d加強免疫1次，抗原量減半，頸部皮下多點注射，共加強免疫3次。首次免疫用弗氏完全佐劑乳化，加強免疫用弗氏不完全佐劑乳化。末次免疫7 d后頸動脈取血，收集血清。

1.7 多克隆抗體的Western blot鑒定

用純化的PBDC1蛋白進行SDS-PAGE電泳，蛋白電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，然后用上述制備的多克隆抗體(TBST稀釋，稀釋度為1∶10 000)4℃孵育過夜。TBST洗膜，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG室溫孵育2 h，最后用化學發光法顯色。

2 結果

2.1 目的基因PBDC1擴增

以cDNA為模板，PCR擴增出1條600 bp左右的條帶(圖1)，與預期基因片段長度一致。

2.2 重組質粒p ET-28a(+)-PBDC1的鑒定

PCR鑒定和雙酶切鑒定結果顯示均在約600 bp處可見一條帶，大小與預期相符(圖2)，經DNA測序證明序列完全正確。陽性克隆命名為BL21/pET-28a(+)-PBDC1。

圖2 重組質粒的PCR鑒定及雙酶切鑒定Fig 2 Identification of recombinant plasmid by PCR and enzyme digestion

2.3 PBDC1蛋白的表達及可溶性分析

BL21/pET-28a(+)-PBDC1經IPTG誘導，在約27 ku處存在大量表達的蛋白，與預期大小相符。PBDC1蛋白在大腸埃希菌中為可溶性表達(圖3)。

2.4 PBDC1蛋白的純化及鑒定

純化得到的PBDC1融合蛋白純度較高，其相對分子質量約為27 ku(圖4)，進一步通過質譜鑒定證實該蛋白確實是PBDC1蛋白。

2.5 多克隆抗體的Western blot鑒定

Western blot結果表明在25 ku和35 ku之間存在特異性條帶，表明制備得到的抗PBDC1蛋白的抗體能與PBDC1蛋白發生免疫印跡反應(圖5)。

3 討論

圖3 PBDC1蛋白的融合表達及可溶性分析Fig 3 Expression of PBDC1 fusion protein and its soluble analysis

圖4 SDS-PAGE檢測純化的PBDC1融合蛋白Fig 4 Identification of purified PBDC1 fusion protein by SDS-PAGE

圖5 多克隆抗體的Western blot鑒定Fig 5 Identification of polyclonal antibody by Western blot

PBDC1是一個新發現的蛋白。目前，有關它的特性及功能尚不了解。在丁酸鈉誘導MEL細胞紅系分化的差異蛋白質組中，發現PBDC1蛋白含量在細胞分化過程中逐漸下調。由此推測PBDC1蛋白參與了紅系分化過程，可能是紅系分化的一個潛在的調控因子。然而，目前還沒有商品化的PBDC1抗體。為了研究它在MEL細胞分化中的功能，本研究擬將PBDC1基因片段插入pET-28a(+)載體，轉入大腸埃希菌BL21(DE3)經IPTG誘導，表達出大量、可溶的PBDC1融合蛋白。通過鎳離子親和層析柱分離純化得到含His標簽的重組蛋白。PBDC1蛋白免疫新西蘭大白兔制備了抗PBDC1蛋白的多克隆抗體，為后續深入研究相關蛋白功能提供實驗材料。

［1］Santini V，Gozzini A，Scappini B，et al．Searching for the magic bullet against cancer:the butyrate saga［J］．Leuk Lymphoma，2001，42:275 －289．

［2］Grebenova D，Kuzelova K，Pluskalova M，et al．The proteomic study of sodium butyrate antiproliferative/cytodifferentiation effects on K562 cells［J］．Blood Cells Mol Dis，2006，37:210－217．

［3］Friend C．Leukemia of adult mice caused by a transmissible agent［J］．Ann N Y Acad Sci，1957，68:522 －532．

［4］J．薩姆布魯克，D．W．拉塞爾．分子克隆實驗指南［M］．3版，北京:科學出版社，2002:518－522．