白芍總苷對HaCaT細胞表達白細胞介素18的影響及相關信號通路的研究

張洪英 王小艷 陳星宇 逄明杰 史同新

白芍總苷對HaCaT細胞表達白細胞介素18的影響及相關信號通路的研究

張洪英 王小艷 陳星宇 逄明杰 史同新

目的觀察白芍總苷(TGP)對角質形成細胞(KC)表達白細胞介素(IL)-18的影響,并初步探討ERK1/2、JNK1/2信號通路在其中的作用。方法將部分HaCaT細胞分為3個組,即對照組加入0.031%二甲基亞砜的細胞培養液,TGP組分別加入6種不同濃度的TGP(0.5、2.5、12.5、62.5、125.0、312.5 mg/L),抑制劑組分別加入10 μmol/L ERKl/2抑制劑PD98059和JNK1/2抑制劑SP600125預處理2 h后,再加入125 mg/L TGP。細胞繼續培養48 h。實時反轉錄(RT)-PCR方法和ELISA方法檢測HaCaT細胞IL-18的表達。部分HaCaT細胞分為兩組,一組用125 mg/L TGP分別處理15,30,60 min,另一組分別用10 μmol/L ERKl/2抑制劑PD98059和JNK1/2抑制劑SP600125預處理后再加入125 mg/L TGP分別處理15,30,60 min。免疫印跡技術觀察兩組HaCaT細胞ERK1/2、JNK1/2磷酸化水平。結果TGP在低濃度(0.5、2.5 mg/L)時對HaCaT細胞IL-18 mRNA和蛋白的表達有促進作用,62.5～125.0 mg/L時可抑制IL-18 mRNA和蛋白的表達,125 mg/L TGP抑制作用最強。TGP(125 mg/L)作用15 min后磷酸化ERKl/2蛋白表達達到高峰,表達水平為0.448±0.018,與對照組(0.204±0.005)比較,差異有統計學意義(P＜0.01);30 min后表達水平降低至0.213±0.005,60 min后為0.217±0.005,與對照組相比差異無統計學意義(均P＞0.05)。PD98059預處理組磷酸化ERK1/2表達水平為0.237±0.010,與單獨125 mg/L TGP給藥組相比,差異有統計學意義(P＜0.01)。125 mg/L TGP對JNK蛋白的磷酸化作用不明顯,各組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。結論TGP可抑制IL-18 mRNA和蛋白的表達, ERK1/2信號途徑可能介導這一抑制作用。

白芍;角蛋白細胞;白細胞介素18;絲裂原激活蛋白激酶類

我們在臨床中應用白芍總苷膠囊(TGP,商品名帕夫林,寧波立華制藥有限公司生產)治療銀屑病取得了較好的療效[1-2],但其作用機制尚未明確。通過既往實驗,我們知道,TGP可通過p38MAPK途徑抑制血管內皮生長因子(VEGF)和IL-23的表達,從而參與抑制角質形成細胞(KC)增殖的過程[3]。近來研究發現,IL-18能促進機體產生Thl型免疫反應,同時能夠抑制Th2免疫應答,在尋常性銀屑病的發生發展過程中起重要作用[4]。在正常人皮膚中,KC是IL-18的主要來源[5]。本實驗中,我們檢測TGP對體外培養的HaCaT細胞表達IL-18的影響,同時觀察TGP對ERK1/2、JNK1/2通路中相關分子磷酸化影響,及ERK/JNK相關抑制劑預處理后TGP對HaCaT細胞IL-18表達的影響,從而探討TGP治療銀屑病的作用機制。

材料與方法

一、材料

TGP由寧波朗生醫藥有限公司提供。臨用前按1∶1(g/ml)以二甲基亞砜(DMSO)溶解,再用培養液配成所需濃度,過濾除菌分裝。RPMI1640細胞培養液、新生牛血清產自杭州四季青生物公司,抗總細胞外信號調節蛋白激酶(T-ERK1/2)、總Jun氨基末端激酶(T-JNK1/2)單克隆抗體產自美國Cell Signaling Technology 公 司 ,ERK1/2 抑 制 劑PD98059、JNK1/2阻斷劑SP600125產自美國Gibco公司,抗磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化JNK 1/2 (p-JNK 1/2)單克隆抗體產自美國Santa Cruz公司, IL-18 ELISA試劑盒產自深圳晶美生物工程有限公司,SYBR Green實時熒光定量PCR檢測試劑盒產自大連Takara公司,總RNA提取試劑盒產自北京天根生化科技有限公司。

二、方法

1.細胞培養:HaCaT細胞由韓國延世大學丁擘曉博士惠贈。培養基采用含有10%新生牛血清的1640培養基,將HaCaT細胞按1×105/ml接種于25或50ml細胞培養瓶中,置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

2.ELISA法檢測細胞培養上清液中IL-18蛋白含量:細胞培養于50 ml培養瓶中。①對照組:含0.031%DMSO的細胞培養液;②TGP組:參照文獻[3]分別加入6種濃度TGP(0.5、2.5、12.5、62.5、125.0、312.5 mg/L);③抑制劑組:10 μmol/L ERKl/2抑制劑PD98059和JNK l/2抑制劑SP600125分別預處理2 h后,加入125 mg/L TGP。細胞繼續培養48 h后,收集細胞培養上清液,采用雙抗體夾心ELISA試驗檢測IL-18蛋白含量,按照操作說明書進行,結束后立即上機測吸光度A值(450 nm),根據各個樣品的A450值,在標準曲線上得出相應的濃度值。

3.反轉錄(RT)-PCR檢測IL-18 mRNA的表達:檢索基因庫,應用Primer 5.0軟件設計上、下游引物,IL-18上游引物為5′-GCCTGGACAGTCAGCA AGGA-3′,下游引物5′-TCTACTGGTTCAGCAGCCA TCTTTA-3′,擴增產物片段大小342 bp;β肌動蛋白上游引物5′-ACACTGTGCCCATCTACG-5′,下游引物5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′,擴增產物片段大小153 bp,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實驗分組同上述蛋白檢測。收集細胞提取總RNA。將提取的總RNA按試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。取cDNA 2 μl,加2.5×RealMasterMix/ SYBR solution 25 μl,上下游引物各1 μl,加DEPC水至反應總體積50 μl,進行定量PCR反應。IL-18反應條件:94℃變性2 min,58℃退火45 s,72℃延伸60 s,共反應40個循環。反應結束后,在ABI Prism SDS 2.0軟件上進行自動分析,查看每個基因的擴增情況,導出相應的域值循環數(Ct),校正cDNA模板的細胞拷貝數,實時RT-PCR結果的計算采用△Ct值法(△Ct值=樣品Ct均值-內參照Ct均值,計算相對量采用2-△△Ct),比較不同待測標本DNA的△Ct值與正常標本DNA△Ct值的變化,對未知標本靶基因的原始拷貝數作出判斷。

4.免疫印跡試驗檢測ERK1/2、JNK1/2:取細胞懸液以5×104細胞/孔接種于50 ml培養瓶中。待細胞長至70%～80%融合狀態時,進行如下處理:①參照文獻[3]用125 mg/L TGP分別刺激細胞15、30、60 min;②分別以 10 μmol/L ERKl/2抑制劑PD98059、JNK1/2抑制劑SP600125預處理2 h后,加入125 mg/LTGP刺激15、30、60 min。收集細胞,檢測p-ERKl/2、T-ERKl/2、p-JNK1/2、T-JNK1/2。加入封閉液稀釋的一抗(p-ERK1/2 1∶1 000、ERK1/2 1∶200,p-JNK1/2 1∶200,JNK1/2 1∶200),置37℃水浴搖床溫育2 h,含吐溫的乙醇胺緩沖鹽溶液(TBST)洗膜,繼與辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗(1∶400)室溫孵育1 h,ECL顯色系統X光片感光顯影。胞質內蛋白表達水平以ERK1/2、JNK1/2與β肌動蛋白光密度比值表示,磷酸化ERK1/2、JNK1/2蛋白表達水平以p-ERK1/2、p-JNK1/2與β肌動蛋白光密度比值表示,應用Qwin圖像分析軟件進行定量分析。

5.統計學處理:應用SPSS 17.0軟件進行統計。統計數據以±s表示,兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、TGP對HaCaT細胞表達和分泌IL-18影響

見表1。0.5、2.5 mg/L TGP作用于HaCaT細胞48 h,IL-18的分泌量及mRNA的表達高于對照組(均P＜0.05);12.5 mg/L TGP作用48 h后HaCaT細胞IL-18的分泌量及mRNA的表達與對照組之間差異無統計學意義(均P＞0.05);TGP在62.5、125 mg/L時,IL-18的分泌及mRNA的表達顯著低于對照組(均P＜0.05),其中在125 mg/L時分泌水平最低(P＜0.01)。

經ERKl/2抑制劑PD98059預處理2 h后,再給予125 mg/L TGP作用24 h,HaCaT細胞IL-18的分泌量及mRNA的表達較單獨125 mg/L TGP作用時明顯增高(均P＜0.01)。經JNK l/2拮抗劑SP600125預處理2 h后,再給予125 mg/L TGP作用24 h,HaCaT細胞IL-18的分泌量及mRNA的表達較單獨125 mg/L TGP作用時,差異無統計學意義(均P＞0.05)。

表1 白芍總苷及相關信號阻斷劑對HaCaT細胞表達和分泌IL-18的影響(±s)

表1 白芍總苷及相關信號阻斷劑對HaCaT細胞表達和分泌IL-18的影響(±s)

注:n=6。與對照組相比,a:P＜0.05,b:P＜0.01;與125 mg/L白芍總苷組比較,c:P＜0.05

組別 IL-18分泌水平(pg/ml) IL-18 mRNA對照組 66.33±2.80 0.007±0.000白芍總苷組0.5 mg/L 78.83±1.94a 0.008±0.000a 2.5 mg/L 81.33±3.44a 0.009±0.000a 12.5 mg/L 64.33±1.63 0.007±0.000 62.5 mg/L 52.17±2.79a 0.004±0.000a 125.0 mg/L 37.17±2.93b 0.002±0.000b 312.5 mg/L 64.50±1.87 0.007±0.000 PD98059+白芍總苷組(125 mg/L) 66.33±2.07c 0.007±0.000c SP600125+白芍總苷組(125 mg/L) 35.33±1.97 0.002±0.000

圖1 125 mg/L白芍總苷作用于HaCaT細胞,磷酸化ERK1/2 (P-ERK1/2)蛋白表達于15 min達到最高

二、TGP對HaCaT細胞ERK1/2、JNK1/2磷酸化的影響

125 mg/LTGP作用于孵育的HaCaT細胞后,磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達于15 min達到最高,表達水平為0.448±0.018,與對照組(0.204± 0.005)比較,差異有統計學意義(t=50.263,P＜0.01),見圖1。30 min后p-ERK1/2表達水平逐漸降低至0.213±0.005,60 min后p-ERK1/2表達水平為0.217±0.005,與對照組相比差異無統計學意義(均P＞0.05)。125 mg/L TGP作用于HaCaT細胞15、30、60 min時JNK蛋白的磷酸化水平與對照組相比,差異無統計學意義(均P＞0.05),見圖2。125 mg/L TGP作用于HaCaT細胞15、30、60 min時T-ERK1/2、T-JNK1/2蛋白表達分別與對照組比較,差異無統計學意義(均P＞0.05)。

圖2 125 mg/L白芍總苷對HaCaT細胞JNK1/2蛋白的磷酸化水平影響不明顯

圖3 HaCaT細胞經ERKl/2抑制劑PD98059預處理2 h后,再給予125 mg/L白芍總苷孵育15 min,p-ERK1/2表達水平與單獨125 mg/L相比明顯下降

圖4 HaCaT細胞經JNK1/2抑制劑SP600125預處理2 h后,再給予125 mg/L白芍總苷孵育15 min,p-JNK1/2表達水平與單獨125 mg/L白芍總苷給藥組相比,差異無統計學意義

HaCaT細胞分別經ERKl/2抑制劑PD98059預處理2 h后,再給予125 mg/L TGP孵育15 min,結果p-ERK1/2表達水平為0.237±0.010,與單獨125 mg/L TGP給藥組相比,差異有統計學意義(t=35.598,P＜0.01),見圖3。JNK1/2抑制劑SP600125(10 μmol/L)預處理2 h后,再給予125 mg/L TGP孵育15 min, p-JNK1/2表達水平與單獨125 mg/L TGP給藥組相比,差異無統計學意義(P＞0.05),見圖4。

討論

MAPK通路是細胞內的重要信號轉導系統,調控細胞的分裂、增殖,主要包括:ERK1/2、JNK和p38。其中,ERK是MAPK家族的經典轉導通路之一,有ERK1和ERK2兩種亞型,在受到刺激時,通過轉錄調節誘發多種癌基因的相繼激活,參與細胞的增生和分化[6]。JNK是哺乳動物細胞中MAPK的另一亞類,JNK家族已克隆10個JNK異構體,它們分別由JNK1、JNK2和JNK3基因編碼,其中JNK1和JNK2在各種組織細胞中廣泛表達。MAPK信號傳導途徑的異常與銀屑病發病密切相關。Haase等[7]認為MAPK激酶的活化可以使角質形成細胞增殖率升高致使表皮過度增生,皮炎發生。Zhang等[8]研究表明與銀屑病患者非皮損區表皮及正常人表皮相比,銀屑病患者皮損中MAPK活性明顯增高,而非皮損區表皮與正常人表皮MAPK活性無明顯差異。Takahashi等[9]研究顯示磷酸化的ERK和JNK在銀屑病受累皮膚較非受累皮膚表達升高。

IL-18是IL-1超家族的成員,在神經系統、內分泌系統和免疫系統間是一種重要的介質[10]。IL-18在皮膚免疫應答中發揮重要作用。角質形成細胞IL-18表達異常,與慢性炎癥性皮膚病密切相關,如銀屑病、特應性皮炎等。角質形成細胞來源的IL-18參與銀屑病皮損局部的Thl免疫反應的發生,其活性受到皮膚炎癥反應的調節,在炎癥反應中具有重要作用[11-13]。研究發現IL-18在銀屑病皮損表皮基底層上KC中表達增加,推測IL-18可能通過誘導IFN-γ在銀屑病的初始炎癥中發揮作用[14]。

TGP藥理作用廣泛,具有抗炎、調節免疫功能,影響細胞增殖、止痛、保肝等作用。目前TGP治療銀屑病作用機制的研究較多集中在Thl/Th2細胞失衡及其相關細胞因子水平的調節。我們在前期研究中發現[3],TGP可抑制VEGF和IL-23的表達,從而參與抑制KC的增殖,p38MAPK途徑可能參與該過程。本研究顯示,TGP可以呈時間依賴性地促進ERK1/2磷酸化,JNK磷酸化不明顯。ERKl/2抑制劑PD98059可以拮抗 TGP對 HaCaT細胞 IL-18 mRNA和蛋白表達的抑制作用。從以上結果我們推測,TGP可以通過ERK1/2途徑,抑制HaCaT細胞對IL-18的表達和分泌,從而減輕銀屑病的炎癥反應。角質形成細胞增殖和表達炎癥因子的信號調控是一個復雜的網絡系統,MAPK、蛋白激酶B(PKB)、核因子kB(NF-kB)、激活蛋白1(AP-1)等信號分子均參與角質形成細胞調控過程,MAPK通路與其他的許多通路之間存在廣泛的交互作用,TGP治療銀屑病的更多的作用機制有待進一步研究。

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2014-03-09)

(本文編輯:尚淑賢)

Effect of total glucosides of paeony on the expression of interleukin-18 in human HaCaT keratinocytes and its related signaling pathways

Zhang Hongying*，Wang Xiaoyan，Chen Xingyu，Pang Mingjie，Shi Tongxin.*Department of Dermatology，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China

Shi Tongxin，Email:shitx2006@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of total glucosides of paeony(TGP)on the expression of interleukin-18(IL-18)in human HaCaT keratinocytes，and to explore the roles of extracelluar signal-regulated protein kinase1/2(ERK1/2)and c-Jun N-terminal kinase 1/2(JNK1/2)signaling pathways in the effect.MethodsSome cultured human HaCaT keratinocytes were classified into three groups:control group treated with dimethyl sulfoxide(0.031%)，TGP groups treated with 6 different concentrations(0.5，2.5，12.5，62.5，125.0 and 312.5 mg/L) of TGP respectively，inhibitor groups treated with TGP of 125 mg/L after 2-hour pretreatment with PD98059(an ERK1/2 inhibitor)and SP600125(a JNK1/2 inhibitor)of 10 μmol/L respectively.After additional culture for 48 hours，reverse transcription(RT)-PCR was performed to measure the mRNA expression level of IL-18，and enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)to determine the level of IL-18 protein in the culture supernatant of HaCaT cells.Some HaCaT keratinocytes were classified into two groups to be treated with TGP of 125 mg/L for 15，30 and 60 minutes with or without the pretreatment with PD98059 and SP600125 of 10 μmol/L;then，Western blot was carried out to determine the phosphorylation levels of ERK1/2 and JNK1/2 in HaCaT cells.ResultsThe levels of IL-18 mRNA and protein in culture supernatant were significantly increased by TGP of 0.5 and 2.5 mg/L，but decreased by TGP of 62.5 and 125.0 mg/L，and TGP of 125.0 mg/L showed the strongest inhibitory effect.After treatment with TGP of 125.0 mg/L，the level of phosphorylated ERK1/2 in HaCaT cells peaked at 15 minutes(0.448 ±0.018)，decreased to 0.213±0.005 at 30 minutes and 0.217±0.005 at 60 minutes，with significant differences between TGP-treated and untreated cells at 15 minutes(0.448±0.018 vs.0.204±0.005，P＜0.05)but not at 30 or 60 minutes(bothP＞0.05).The phosphorylation level of ERK1/2 was 0.237±0.010 in HaCaT cells pretreated with PD98059 prior to the treatment with TGP，significantly different from that in HaCaT cells treated with TGP only(P＜0.01).TGP of 125.0 mg/L had no obvious effect on JNK phosphorylation，and there was no significant difference in the level of phosphorylated JNK1/2 between HaCaT cells untreated and those treated with TGP of 125.0 mg/L for different durations(allP＞0.05).ConclusionsTGP can inhibit the expression of IL-18 mRNA and protein in HaCaT cells，likely through the ERK1/2 signaling pathway.

RADIX PAEONIAE ALBA;Keratinocytes;Interleukin-18;Mitogen-activated protein kinases

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.012

青島市科技局課題(10-3-3-4-20-nsh)

260011青島市市立醫院皮膚科(張洪英、王小艷、陳星宇、史同新),耳鼻喉科(逢明杰)

史同新,Email:shitx2006@163.com