骨性關節炎患者疼痛抑制中TRPM8表達的臨床意義研究

潘永春 楊朝暉

山西醫科大學第二醫院骨創科，山西太原 030001

骨性關節炎（OA）是多發生于中老年人群的一種退行性關節病，主要與軟骨退變、滑膜炎癥等有關，表現為關節疼痛、腫脹等，嚴重影響患者生活質量。目前臨床上治療OA 常見藥物為透明質酸、非甾體抗炎藥等，雖然能有效緩解疼痛及炎癥，但副作用大。眾所周知冰敷等適當冷刺激能緩解疼痛（如關節痛、偏頭痛等），但過低則會加重疼痛或冷覺過敏，表明冷覺和疼痛間存在某種關聯，但其作用機制還不是很了解[1]。隨著分子學、生物學的不斷進步，部分研究證明TRPs（瞬時受體電位離子通道）參與機體溫度感知，而TRPM8（冷覺感受器受體M8）是TRPs 家族的重要一員，在冷刺激感知上起重要作用[2]。該研究就此于2013年1月—2014年1月通過骨性關節炎小鼠建模試驗分析TRPM8表達在疼痛抑制中的作用。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇32 只成年健康SD 大鼠為研究對象，鼠齡基本相近，平均體重（300.5±18.5）g，飼養在安靜環境，不限制其自由活動。材料：本研究包括弗氏佐劑、微量注射器針頭、顯微鏡、TRPM8 抗體、薄荷醇等。

1.2 方法

①鞘內置管。大鼠腹腔中注射300～350 mg/kg 水合氯醛，將其麻醉后于大鼠枕骨大孔處行縱切口，依次切開皮膚、皮下組織后把硬脊膜暴露出來，將其剪開待腦脊液流出后于蛛網膜下置入導管（PE-10 聚乙烯），長度為7 cm 左右，隨后依次縫合且固定導管，同時通過向導管中注射利多卡因檢查其置入是否正確；②骨性關節炎大鼠建模。水合氯醛（10%）麻醉后幫助大鼠選擇俯臥位，先用乙醇消毒其右側外踝附近皮膚，隨后從外踝外側凹陷部位用胰島素注射器皮下穿刺，隨后轉向足尖，刺進腓骨、距骨間踝關節腔，進針深5 mm 左右，加壓后注入50 μL弗氏佐劑，退針后用棉球按壓一會；③給藥。把大鼠放置到固定器中，從固定器頸部口引出導管，并與胰島素注射器連接，先向導管內注入5 μL 生理鹽水，確定導管通常后再注入20 μL試驗用藥，隨后再注射一定量的生理鹽水，讓導管內藥物完全進到鞘內。將所有大鼠分為NS-NS 組、CFA-NS 組、CFA-Menthol 組和NS-Menthol 組，各8 只。模型制備后第2 個星期分別注射薄荷醇或生理鹽水20 μL。薄荷醇劑量為100 ug/kg。用藥前后測定和記錄各組大鼠抬爪次數、熱痛敏分數及機械痛敏闕值等行為學指標。另外用藥后1 個星期將大鼠處死，將右側L5DRG 保存在灌注液中，24～48 h 行石蠟包埋處理，制成4 um切片，同時行免疫組化染色，通過顯微鏡觀察TRPM8 表達。

1.3 統計方法

應用SPSS16.0 統計學軟件對上述相關數據進行分析，計量資料均數±標準差（±s）表示，t 檢驗。

2 結果

2.1 不同組別大鼠行為學指標比較

與用藥前比較，CFA-Menthol 組大鼠給藥后大鼠抬爪次數、熱痛敏分數及機械痛敏闕值有明顯差異，差異有統計學意義（P＜0.05）。其他組用藥前后指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同組別大鼠行為學指標比較（±s,n=8）

表1 不同組別大鼠行為學指標比較（±s,n=8）

注：與給藥前比較，*P＜0.05。

組別NS-NS 組CFA-NS 組CFA-Menthol 組NS-Menthol 組抬爪次數熱痛敏分數給藥前給藥后給藥前給藥后4.62±0.91 11.01±0.75 10.76±0.70 4.51±0.92 5.02±0.92 11.26±1.05（14.76±0.70）*4.64±1.05 0.87±0.38 7.35±0.27 7.34±0.30 0.85±0.30 1.06±0.31 7.30±0.26（2.65±0.26）*0.98±0.43機械痛敏闕值給藥前給藥后22.24±0.80 6.71±0.56 6.52±0.44 22.01±0.93 22.10±1.04 6.65±0.65（17.36±0.64）*22.14±1.11

2.2 各組大鼠TRPM8 表達比較

CFA-NS 組、CFA-Menthol 組大鼠TRPM8 表達明顯高于NS-NS 組、NS-Menthol 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠TRPM8 表達比較（±s,n=8）

表2 各組大鼠TRPM8 表達比較（±s,n=8）

注：與NS-NS 組比較，*P＜0.05。

組別TRPM8 表達NS-NS 組CFA-NS 組CFA-Menthol 組NS-Menthol 組78.07±3.30 155.85±1.91*157.35±1.47*78.07±2.88

3 討論

3.1 TRPM8 在冷覺傳導中的作用

相關離體實驗表明，在DRG（背根神經節）細胞上可以觀察到冷覺感受器受體M8 與冷覺感受器受體V1 共存現象，提示TRPM8 可能參與傷害性冷刺激傳導[3]。相關研究表明緩激肽、磷脂等炎癥因子都可能激活TRPM8[4]。

冷反應的介導主要由C 類神經纖維及類Aδ 負責，而這些物質能產生一種或多種冷感覺。動物實驗表明大鼠大部分冷反應主要與TRPM8 受體有關，TRPM8 通過電流能被26℃以下的溫度激活，包括傷害性冷刺激[5]。但實驗也發現TRPM8 缺陷小鼠對非傷害性冷刺激感知能力下降，且同時失去對傷害性冷刺激的自我保護行為，另外對這些小鼠C 類神經纖維及類Aδ 研究發現冷刺激引發的行為反應明顯減少或者缺失。可見TRPM8 在冷覺傳導中起重要作用[6]。

TRPM8 在不同神經細胞亞群中均有表達，且不同亞群感覺能力也不一樣，當TRPM8 被激活后產生的冷知覺則由其他機制影響。Bautista[7]等人研究發現對于缺陷TRPM8 的小鼠模型來說，它們對15～25℃的感知能力喪失，但卻對15℃以下的冷溫度有一定的逃避能力，這提示TRPM8 的主要作用是參與非傷害性冷刺激及部分傷害性冷刺激，這從側面反映除了TRPM8 傳導冷刺激外，還有其他作用機制，特別是對傷害性冷刺激起傳導作用。

3.2 TRPM8 在疼痛抑制中的可能機制

神經元亞群中若含有C 類神經纖維及類Aδ，則可能對15～30℃、15℃以下的溫度產生行為反應。相關研究表明慢性疼痛大鼠機體TRPM8（陽性C 纖維、陽性Aδ 纖維）上調，則表明TRPM8表達可能通過參與薄荷醇起鎮痛效果[8]。Produfoot等[9]人研究發現皮膚溫度下降到16℃、薄荷醇或icilin 等對TRPM8 受體產生刺激作用，導致其參與到神經病理性疼痛大鼠鎮痛過程，且該鎮痛效果無法被納洛酮拮抗，表明TRPM8 抑制疼痛的作用原理和傳統阿片鎮痛沒有關聯。但研究發現該鎮痛效果卻可以被II/III mGluRs 拮抗劑選擇性的逆轉，表明TRPM8 激活后鎮痛作用主要由中樞介導，且依賴于II/III mGluRs。這是因為II mGluRs 在初級傳入感覺神經通路突觸前、突觸后中比較常見，而III mGluRs絕大部分分布在突觸前，將II/III mGluRs 激活后便可對脊髓背角傳入神經引發的電位變化起抑制作用。相關文獻表明培養基與切片脊髓背角、DRG 的某些突觸，給予薄荷醇補充后能提高突觸后電位（興奮性）頻率，這和TRPM8 表達陽性傳入神經激活，釋放出大量的谷氨酸一致[10]。骨性關節炎病發后TRPM8 介導鎮痛作用機制為：TRPM8 陽性表達傳導到神經纖維中，釋放出一定量的葡萄糖（Glu），介導ivilin 后達到鎮痛的目的，其機制為激活傷害性傳入纖維突觸前或突觸后II/III mGluRs，進而使疼痛相關神經損傷緩解引起。

薄荷醇具有清涼作用，可用于醫用刺激藥，外用有清涼止癢功效，內服可止痛，適用于頭痛、咽喉痛等疾病。從表1 可知，CFA-Menthol 組大鼠給藥前后大鼠抬爪次數、熱痛敏分數及機械痛敏闕值比較差異有統計學意義（P＜0.05）。表明薄荷醇的止痛作用。且表2 中，CFA-NS 組、CFA-Menthol 組大鼠TRPM8 表達明明顯比NS-NS 組、NS-Menthol 組高，差異有統計學意義（P＜0.05），從側面表明TRPM8 可以有效被薄荷醇激活，發揮其疼痛抑制作用。

另外，TRPM8 不僅可以被薄荷醇、icilin 激活，而且還受pH值影響，當pH 值在6 以下時，TRPM8 對冷刺激反應完成消失；當pH 值在6.5～8.1 之間時，TRPM8 激活溫度在15～27℃之間。同時細胞內pH 值變化對TRPM8 激活能力影響比較大，當pH 值增加到7.4 時，icilin 激活TRPM8 能力較之前提高4 倍；當pH 值下降到6.5 時，icilin 激活TRPM8 能力則明顯下降。但pH 值變化對薄荷醇激活TRPM8 的能力基本沒有影響，當icilin 失去TRPM8 激活能力后，薄荷醇還是可以激活TRPM8，提示TRPM8激活機制在兩種及以上，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，TRPM8 表達主要作用是監測冷刺激，促成損傷后冷覺過敏以鎮痛。薄荷醇不僅具有鎮痛作用，而且還可以激活TRPM8 受體加強冷覺過敏，以充分發揮冷鎮痛效果，但TRPM8在骨性關節炎疼痛抑制中的作用機制需進一步研究。

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[6]蘇林,王國林.TRPM8 與神經病理性疼痛[J].國際麻醉學與復蘇雜志,2011,32(1)：96-100.

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