嗜線蟲致病桿菌HB310 培養基篩選和培養條件優化

王永娟，張 杰，孔繁芳，南宮自艷，宋 萍，王勤英

(河北農業大學植物保護學院，河北保定 071000)

嗜線蟲致病桿菌Xenorhabdus nematophila 與小卷蛾斯氏線蟲Steinerne macarpocapsae 呈互惠共生關系，線蟲-共生菌復合體共同侵染昆蟲，短時間內造成昆蟲患敗血病死亡，在防治多種地下害蟲中起重要作用。研究表明，嗜線蟲致病桿菌可以分泌多種殺蟲物質，在線蟲-共生菌復合體中起殺死昆蟲的作用(Park et al.，2000;Owuama，2001)。近年來，隨著研究不斷深入，除殺蟲活性外，嗜線蟲致病桿菌其他功能也被不斷發現，可以合成各種抗菌物質，對多種植物病原微生物具有抑制作用(劉霞等，2006;馬麗麗等，2007);與蘇云金芽孢桿菌(Sungchae et al.，2006)、化學殺蟲劑(李立濤等，2011)混合使用可以提高殺蟲效果。嗜線蟲致病桿菌具有殺蟲譜廣、殺蟲活性高、抑菌作用強等優點，具有廣闊的開發利用前景，世界各國對共生菌資源亦日趨重視。

近年來有關嗜線蟲致病桿菌發酵的研究也成為了熱點，但是相關研究內容主要集中在抗生素的產生和抑菌活性上(李騫等，2006)，而關于影響嗜線蟲致病桿菌殺蟲活性的發酵因子卻很少報道。嗜線蟲致病桿菌Xn HB310 是本實驗室分離得到的一株具有高殺蟲活性的菌株，前期工作對它的殺蟲活性和殺蟲機理進行了深入研究(王勤英等，2005;Wang et al.，2012)。本實驗針對Xn HB310 菌株殺蟲活性，利用正交試驗對發酵培養基進行優化，明確其最佳發酵條件，提高發酵效率，為以后規模化、商品化生產微生物殺蟲劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株:嗜線蟲治病桿菌HB310 菌株(Xn HB310)保存于河北農業大學害蟲生物防治實驗室，從小卷蛾斯氏線蟲體內分離獲得，以NBTA 為鑒別培養基確定菌株的初生型。

供試蟲源:小菜蛾Plutella xylostella 由河北農業大學害蟲生物防治實驗室提供，置于25±1℃，RH 65%-75%、光照16 h 的人工氣候箱內，用蘿卜苗飼養至2 齡幼蟲，挑選健康整齊幼蟲供試。

培養基:NBTA 鑒別培養基(營養瓊脂45 g，氯化三苯基四氮唑0.04 g，溴百里酚藍0.025 g)、BR 培養基(牛肉蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g)、NA 培養基(牛肉膏5 g，牛肉蛋白胨6 g，NaCl 5 g)、KB 培養基(牛肉蛋白胨5 g，酵母浸粉3 g，葡萄糖2.5 g)、BM 培養基((NH4)2SO41 g，K2HPO47 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，葡萄糖1 g，牛肉蛋白胨1 g，酵母浸粉5 g)、BPY培養基(牛肉蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖5 g)和YS 培養基((NH4)2SO40.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 5 g，酵母提取物5 g)。以上培養基皆定容1000 mL，pH 值7.0-7.2。

1.2 生物測定方法

采用浸葉法對小菜蛾進行生物測定(李立濤等，2011)，取甘藍葉片在加有0.3% 吐溫-80 的菌液中浸泡10 s，取出后自然晾干，放入滅菌養蟲盒中，接入小菜蛾2 齡幼蟲，每盒15 頭，每個處理設3 次重復，以含有0.3% 吐溫-80 的無菌水處理作為對照，25℃培養72 h 后，統計死亡數并計算死亡率。對生測數據均通過DPS 軟件分析，采用Dunan's 新復極差法統計分析，數據均為平均數±SE (mean±SE)。

1.3 基礎培養基的篩選

從NBTA 培養基上挑取Xn HB310 初生型單菌落，接入BR 培養基中，28℃、200 rpm 培養14 h，按1% 接種量分別接入到不同培養基，28℃、200 rpm培養，每隔2 h 取一次菌液測定OD600，培養48 h 后，測定其殺蟲活性，方法見1.2。

1.4 最佳碳源、氮源和無機鹽的選擇與優化

采用單因素方法確定最佳三大營養源。分別在BR 培養基中加入1%的蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖為不同碳源;以1.5%的牛肉蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、干酪素和尿素作為不同氮源;以0.5% 的 MgSO4、MgCl2、KCl、(NH4)2SO4、KH2PO4和NaH2PO4為無機鹽，其他組分相同，28℃、200 rpm 培養48 h 后檢測菌株OD600，測定其殺蟲活性，方法見1.2。

在確定最佳碳源、氮源和無機鹽的基礎上，采用正交實驗設計優化三大營養源的用量，因素水平見表1，其中A 因素為葡萄糖、B 因素為牛肉蛋白胨、C 因素為牛肉浸膏和D 因素為KH2PO4。

表1 培養基優化設計表Table 1 Optimization design of medium

1.5 培養條件的優化

本實驗分別對接種量、培養時間、溫度、培養基初始pH 值、搖床轉速和裝液量等6 個因素對菌株生長及殺蟲活性的影響進行了研究，并確定了最佳的培養方案。原始發酵條件為:將種子菌以1%接種接入到置于500 mL 搖瓶內的100 mL BR培養基中，200 rpm、28℃培養48 h。測定菌液OD600和殺蟲活性。

2 結果與分析

2.1 基礎培養基對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的影響

將Xn HB310 菌株分別接入6種不同培養基，在不同時間點測定菌液OD600，繪制生長曲線，最后測定各菌液的殺蟲活性，結果見圖1 和圖2。從圖1 可以看出，Xn HB310 菌株在BR 培養基中OD600最高，生長情況最好;圖2 也顯示BR 培養基中的Xn HB310 菌株殺蟲活性高于其他培養基，且差異顯著(P≤0.05，下同)。因此選擇BR 培養基作為后繼研究的基礎培養基。

圖1 嗜線蟲致病桿菌HB310 在不同培養基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of Xenorhabdus nematophila HB310 in the different culture medium

圖2 嗜線蟲致病桿菌HB310 在不同培養基中對小菜蛾幼蟲的殺蟲活性Fig.2 Insectical activity of X.nematophila HB310 in the different culture medium against the larvae P.xylostella

2.2 碳源對Xn HB310 菌株生長及殺蟲活性的影響

由表2 可以看出，當以葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為碳源時，Xn HB310 菌株的殺蟲活性高于以果糖和麥芽糖為碳源時的活性，而且前三者沒有顯著差異;但是以葡萄糖為碳源時，菌液OD600顯著高于其它碳源。綜合以上兩個因素考慮，選擇葡萄糖為最佳碳源。

表2 不同碳源對嗜線蟲致病桿菌Xn HB310生長及殺蟲活性的影響Table 2 Effect of different carbon sources on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.3 氮源對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的影響

不同氮源對Xn HB310 菌株的影響見表3，由表3 可以看出，以牛肉浸膏和牛肉蛋白胨為氮源時，培養的Xn HB310 菌液的殺蟲活性顯著高于其它氮源。雖然以牛肉浸膏和牛肉蛋白胨為氮源的培養基培養的菌液OD600值差異顯著，但是兩種菌液對小菜蛾致死率都很高，且差異不顯著，所以選擇牛肉浸膏和牛肉蛋白胨共為最佳氮源。

2.4 無機鹽對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的影響

測定不同無機鹽對Xn HB310 菌株影響，結果顯示(表4)，當以KH2PO4和NaH2PO4作為無機鹽時，Xn HB310 菌株的殺蟲活性高于其它無機鹽，并且無顯著差異，但是菌液在KH2PO4條件下生長情況優于后者，所以選擇KH2PO4作為最適無機鹽。

表3 不同氮源對嗜線蟲致病桿菌HB310 生長及殺蟲活性的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on the growth and insecticidal activity of X.nematophila HB310

表4 無機鹽對嗜線蟲致病桿菌HB310 生長及殺蟲活性的影響Table 4 Effect of inorganic salt on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.5 培養基的優化

在確定最適碳源、氮源和無機鹽的基礎上，采用正交實驗對Xn HB310 發酵培養基成分的用量進行了優化。表5 結果表明，葡萄糖的用量對Xn HB310 菌株產殺蟲活性物質的影響最大，增加葡萄糖用量可顯著提高菌株的殺蟲活性，其次是牛肉蛋白胨，葡萄糖與牛肉蛋白胨的交互作用可忽略不計，而葡萄糖與牛肉浸膏的交互作用對產殺蟲活性物質有一定的影響。從均值1 和均值2 可以看出，培養基的優化組合為葡萄糖2%，牛肉蛋白胨1%，牛肉浸膏0.3%和K2HPO41%。將其培養的Xn HB310 菌液稀釋10 倍對小菜蛾二齡幼蟲的致死率為92%，而以稀釋10 倍BR 培養基培養的Xn HB310 菌液，對小菜蛾二齡幼蟲的致死率為60.7%。

表5 培養基的優化Table 5 Optimization of medium

2.6 接種量對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的影響

接種量對Xn HB310 的影響結果表明(見表6)，當接種量在3%-6%時，小菜蛾幼蟲的死亡率無顯著差異，皆高于其他接種量，但是，當接種量為6%時，菌液OD600顯著高于其他接種量，因此選擇6%的接種量進行接種。

表6 接種量對嗜線蟲致病桿菌HB310 生長及殺蟲活性的影響Table 6 Effect of inoculum size on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

(續上表)

2.7 培養時間對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的的影響

分別取培養不同時間的Xn HB310 菌液，檢測其生長情況并測定殺蟲活性，結果見表7。由表7可以看出，隨著培養時間延長，Xn HB310 菌株的OD600隨之升高，殺蟲活性也同步提高，到達48 h時，兩項指標達到最高值，顯著高于其他培養時間，之后隨著時間的延長，菌株的生長情況和殺蟲活性呈下降趨勢，說明菌液由穩定期發展為衰亡期，菌液殺蟲活性也隨之下降。綜上所述，選擇48 h 作為發酵時間。

表7 培養時間對嗜線蟲致病桿菌HB310 生長及殺蟲活性的影響Table 7 Effect of culturing time on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.8 培養溫度對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的影響

不同溫度對菌株發酵影響結果見表8。由表8可以看出，不同溫度對菌株的發酵影響較大，溫度過高或過低，菌株生長緩慢甚至停止生長，失去殺蟲活性;當溫度為28℃時，Xn HB310 的OD600和殺蟲活性最高，且差異性顯著，因此選擇28℃為菌株Xn HB310 最適發酵溫度。

2.9 培養基初始pH 值對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的影響

培養基不同pH 值對菌株Xn HB310 生長影響見表9。結果表明，pH 值在6.0-7.5 范圍之間，菌株Xn HB310 的OD600及殺蟲活性隨pH 值升高而升高;當pH 值達到7.5 時，菌液生長和殺蟲活性都顯著高于其他pH 值;當高于8.0 時，菌株生長和殺蟲活性就受到抑制。因以選用pH 值7.5 為發酵培養基的初始pH 值。

表9 初始pH 值對嗜線蟲致病桿菌HB310 生長及殺蟲活性的影響Table 9 Effect of initial pH value on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.10 搖床轉速對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的影響

設定不同轉速對Xn HB310 菌株進行發酵，48 h 時檢測菌液的OD600值和殺蟲活性。結果如表10 所示，隨著轉速的升高，OD600值隨之增加，菌株生長速度加快，殺蟲活性也逐漸升高;轉速為200 rpm 時，Xn HB310 的OD600和殺蟲活性達到最高，且差異性顯著;當達到250 rpm 時，OD600值和殺蟲活性都有所降低，所以選用轉速為200 rpm。

表10 搖床轉速對Xn HB310 生長及殺蟲活性的影響Table10 Effect of shaking speed on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.11 裝液量對Xn HB310 菌株生長和殺蟲活性的影響

在500 mL 搖瓶中分別加入不同體積培養基，對Xn HB310 進行發酵培養，結果表明，當裝液量在50-150 mL 之間時，殺蟲活性較高且差異不顯著，當裝液量為100 mL 時，菌株OD600值顯著高于其他裝液量，說明該裝液量最適合菌株生長，因此選擇100 mL/500 mL 三角瓶裝液量來進行發酵培養。

表11 裝液量對嗜線蟲致病桿菌HB310 生長及殺蟲活性的影響Table 11 Effect of loading amount on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

3 結論與討論

小菜蛾的危害具有隱蔽性且世代重疊嚴重，防治十分困難，因此小菜蛾已經成為世界性害蟲。在田間，小菜蛾對多種化學農藥及生物農藥Bt(Liu et al.，1998;楊峰山等，2006)已經表現出了很強抗性，所以開發和推廣新的殺蟲資源至關重要。本實驗室前期研究發現，嗜線蟲致病桿菌Xn HB310 對小菜蛾具有很強的殺蟲效果(王勤英等，2004)。楊云艷等(2012)針對嗜線蟲致病桿菌對小菜蛾的致死和亞致死效應進行了評價，發現Xn HB310 不僅對小菜蛾幼蟲有很強的殺蟲活性，而且與Bt 無交互抗性。Wang 等(2012)對Xn HB310 菌株的殺蟲機理進行了研究，他們從菌體細胞中分離出了一種復合蛋白Xnpt，通過組織病理學研究發現，Xnpt 可以破壞中腸組織和抑制中腸蛋白酶活性，對小菜蛾具有拒食作用和致死作用。此外，近期研究表明，來自昆蟲病原線蟲共生菌的這類復合殺蟲蛋白毒素的殺蟲機理不同于Bt Cry 毒素(Meusch，et al.，2014)，因此嗜線蟲致病桿菌作為治理Bt 抗性小菜蛾種群的一種新的生防武器，具有潛在的開發利用價值。

本研究以Xn HB310 菌液OD600值和殺蟲活性為指標，采用單因素方法和正交試驗來優化菌株Xn HB310 的發酵條件，最終得到最優培養基和最佳發酵條件。優化后的菌液殺蟲活性比對照提高了31.3%。本研究中，溫度和培養基pH 值是影響菌株生長的最主要因素，當溫度和pH 值過高或過低時，菌株無法正常生長，殺蟲活性也急劇下降，甚至失去殺蟲活性。這可能是由于溫度和pH 值不但影響菌株的代謝速度，而且可能會造成代謝走向發生不可逆的改變。其他因素對菌株的生長代謝有一定影響，影響效果雖不及以上兩個因素，但是如果作為微生物殺蟲劑進行發酵生產，其它因素也不可忽略。

楊秀芬等 (2006)曾針對致病桿菌 D43(Xenorhabdus sp.D43)的抑菌活性對其發酵條件進行了研究，確定該菌株的最佳三大營養源為麥芽糖、牛肉蛋白胨和CaCl2。這與本實驗結論不同，可能是由于嗜線蟲致病桿菌產生殺蟲蛋白所需營養不同于產生抑菌物質所需營養。但是，楊秀芬等(2006)所提出的接種量、裝液量和培養基初始pH 值的結論與本實驗一致，說明嗜線蟲致病桿菌殺蟲和抑菌的最適條件是相似的。因此，針對不同目的摸索相應的發酵條件以達到最好的效果是必須的。

發酵優化是生防微生物產業化的前期基礎，本研究初步探索了實驗室條件下不同營養物質和發酵條件對Xn HB310 菌株殺蟲活性的影響，為進行下一步發酵罐發酵提供了理論基礎。但是作為產品進行商品化推廣還會受到發酵技術和生產成本等因素的影響，需要開發更加廉價高效的發酵方法，這就有待于進一步的試驗探索。

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