黃孢原毛平革菌脂肪合成現(xiàn)象的探討

楊益君 費婷

(杭州杭康衛(wèi)生檢測技術(shù)有限公司,浙江杭州 310000)

黃孢原毛平革菌脂肪合成現(xiàn)象的探討

楊益君 費婷

(杭州杭康衛(wèi)生檢測技術(shù)有限公司,浙江杭州 310000)

本文以土豆濾液配制Kirk培養(yǎng)基培養(yǎng)黃孢原毛平革菌,從定性方面研究其產(chǎn)脂規(guī)律。

黃孢原毛平革菌 脂肪含量

1 前言

20世紀80年代以來，國內(nèi)外學者一直著眼于研究微生物產(chǎn)脂這一課題，其中細菌和真菌的產(chǎn)脂規(guī)律更是研究的熱點，本文以黃孢原毛平革菌(phanerovhaete chrysosporium Burd．)作為實驗對象，在定性方面，采用蘇丹黑B染色法，在顯微鏡下觀察黃孢原毛平革菌菌絲體內(nèi)的脂肪粒，對黃孢原毛平革菌的脂肪合成代謝規(guī)律進行分析。

2 實驗材料

2.1 菌種來源

本研究選用的白腐真菌菌種為黃孢原毛平革菌(phanerovhaete chrysosporium Burd．)，由中國科學院微生物研究所菌種保藏中心提供。

2.2 培養(yǎng)基材

PDA培養(yǎng)基:稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎放入鍋中，加入1000ml純水，置于電爐上加熱，待沸騰后開始計時，30min后停止加熱。稍稍冷卻后，用紗布過濾，將上清液倒入事先準備好的500ml錐形瓶中。然后在高壓滅菌鍋(121℃，1．2大氣壓)中滅菌20min，滅菌后冷卻，放入冷藏柜，保存?zhèn)溆谩Ｒ迫?00ml預制的土豆濾液，加入4g葡萄糖和10g瓊脂，充分溶解后在高壓滅菌鍋(121℃，1．2大氣壓)中滅菌20min，取出后倒入培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中倒入約15～20ml，冷卻凝固。

Kirk培養(yǎng)基:10g/L葡萄糖、0．221g/L酒石酸銨、2．0g/LKH2PO4、0．5g/LMgSO4·7H2O、0．132g/LCaCl2、1mg/LVB1及1ml/L微量元素、100mL醋酸緩沖劑(pH6．0)，以土豆濾液為溶劑，定容至1000ml。

2.3 實驗試劑

藏紅T；二甲苯；無水乙醇；鹽酸；乙醚；石油醚(30℃～60℃沸程)；葡萄糖；酒石酸銨；KH2PO4；CaCl2；MgSO4·7H2O；VB1；醋酸鈉；冰醋酸。以上化學試劑均為分析純。

2.4 實驗儀器設(shè)備

本實驗使用的主要實驗儀器:FL-107顯微鏡；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器；GSP-9050MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱；AB135-S梅特勒電子分析天平等。

3 實驗方法

3.1 黃孢原毛平革菌培養(yǎng)方法

圖1 黃孢原毛平革菌生物量變化

采用靜置培養(yǎng)方式，將配制的Kirk培養(yǎng)基分別裝入培養(yǎng)瓶中，每瓶培養(yǎng)瓶中裝50ml培養(yǎng)基，在高壓滅菌鍋(121℃，1．2大氣壓)中滅菌40 min。滅菌后，把培養(yǎng)瓶從高壓滅菌鍋中取出，待冷卻至室溫。采用打孔器(直徑1．0cm)在PDA培養(yǎng)基上打孔取黃孢原毛平革菌的菌塊，然后將菌塊接入培養(yǎng)瓶里，使菌塊漂浮在Kirk培養(yǎng)基表面。接種后將培養(yǎng)瓶放入溫度為25℃，濕度為65%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個培養(yǎng)基設(shè)置4個平行樣。

3.2 生物量測定辦法

先把定量濾紙放到80℃的烘箱中烘至恒重，然后放到干燥器中冷卻到室溫稱重得質(zhì)量m1。用布氏漏斗過濾分離菌球與培養(yǎng)基，濾出菌球后把濾紙及濾紙上的菌球放到40～60℃的干燥箱中烘至恒重。然后放到干燥器中冷卻到室溫稱重得質(zhì)量m2。菌絲體干重

3.3 蘇丹黑B染色法

滴一滴蒸餾水于載玻片上，挑取少許菌絲體于其中進行熱固定。待冷卻后，加一滴0．3%蘇丹黑B染色液，自然干燥10～15min。再滴加二甲苯脫色直至洗出液透明。干燥后，番紅復染1～2min，水洗至洗出液透明。干燥后鏡檢，在光學顯微鏡(1600×)下觀察[2]。

3.4 脂肪含量測定方法

脂肪含量測定方法采用GB/T 5009．6-2003《食品中脂肪的測定》中的酸熱法[1]。

4 結(jié)果與分析

4.1 黃孢原毛平革菌產(chǎn)脂情況

4.1.1 黃孢原毛平革菌生物量的變化

在溫度為25℃，濕度為65%的培養(yǎng)箱中，用Kirk培養(yǎng)基培養(yǎng)黃孢原毛平革菌，觀察黃孢原毛平革菌的生長情況，并且測定其在不同培養(yǎng)時間的生物量，運用t檢驗分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異，探討黃孢原毛平革菌生物量的變化趨勢，結(jié)果如圖1所示。

通過t檢驗，從圖1中發(fā)現(xiàn)第2、4、6、8、10天之間的生物量都具有顯著性差異(P＜0．05)，第10、12、14天之間的生物量沒有顯著性差異(P＞0．05)，可知第2、4、6、8天的生物量快速增長，第10天的生物量有所下降，而從第10天開始黃孢原毛平革菌的生物量基本不變，維持一個平穩(wěn)的狀態(tài)。

由此得出，黃孢原毛平革菌在其生長過程中，初始階段生物量會有一個迅速增長的趨勢，第8天，黃孢原毛平革菌獲得了最大的生

圖2 黃孢原毛平革菌菌絲體中脂肪含量變化

物量，為0．5457g，而從第8天到第10天，生物量又會出現(xiàn)短時間的下降趨勢。從第10天開始，黃孢原毛平革菌的生物量基本保持不變。

4.1.2 黃孢原毛平革菌產(chǎn)脂量的變化

采用酸熱法來測定不同培養(yǎng)時間的黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量。通過測定菌絲體中的脂肪含量，運用t檢驗分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異，來探討黃孢原毛平革菌在培養(yǎng)過程中是否存在脂肪的合成，并且分析其產(chǎn)脂規(guī)律。

如圖2所示，第6天，菌絲體中的脂肪含量達到最高值，即為16．29%。通過t檢驗，可以發(fā)現(xiàn)第2、4、6天之間的黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量有顯著性差異(P＜0．05)，得到第2、4、6天黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量呈上升趨勢。這可能是因為黃孢原毛平革菌的代謝發(fā)生歧化作用，進入了油脂合成階段。第6、8、10、12天之間的黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量也有顯著性差異(P＜0．05)，得到第6、8、10、12天黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量呈下降趨勢。其原因可能是由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)不足，以致于黃孢原毛平革菌以生成的脂肪作為能源來維持自身的生長。第12、14天之間的黃孢原毛平革菌菌絲體中的脂肪含量沒有顯著性差異(P＞0．05)，從第12天開始，菌絲體中的脂肪含量維持一個平穩(wěn)的狀態(tài)。

4.2 黃孢原毛平革菌菌絲體染色結(jié)果

本實驗采用蘇丹黑B染色法對第2、6、12天的黃孢原毛平革菌菌絲體進行染色。采用蘇丹黑B染色后，菌絲體中的脂肪粒呈現(xiàn)藍灰色，由此可以直觀地判斷菌絲體中脂肪含量的多寡。

在第2、6、12天，菌絲體內(nèi)都存在藍灰色脂肪粒，并且呈現(xiàn)出先增加后減少的現(xiàn)象。第6天，脂肪粒的數(shù)量最多并且分布密集，菌絲體脂肪含量達到最高值。這與圖2中菌絲體內(nèi)的脂肪含量呈現(xiàn)先增加后減少再趨于平穩(wěn)的趨勢基本符合。

綜上所述，通過黃孢原毛平革菌菌絲體的鏡檢結(jié)果，可以說明在黃孢原毛平革菌的生長過程中有脂肪的合成，并且其變化趨勢與產(chǎn)脂培養(yǎng)實驗結(jié)果基本一致。通過生物量、菌絲體的變化，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過程中，生物量、菌絲體中脂肪含量都呈現(xiàn)先增加后減少再趨于平穩(wěn)的趨勢。

5 結(jié)語

本實驗從定性方面來論述這一研究課題。運用蘇丹黑B染色法對第2、6、12天的黃孢原毛平革菌菌絲體進行染色，在光學顯微鏡下觀察到第2、6、12天的黃孢原毛平革菌菌絲體內(nèi)均存在藍灰色的脂肪粒，并且脂肪粒的數(shù)量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，說明在黃孢原毛平革菌的生長過程中有脂肪的合成，其變化趨勢與產(chǎn)脂培養(yǎng)實驗中所得到的數(shù)據(jù)相符。

[1] GB/T 5009.6-2003.食品中脂肪的測定[S].北京:中國標準出版社,2003.

[2] 李元森.產(chǎn)油脂絲狀真菌的篩選及其產(chǎn)油脂條件的優(yōu)化[D].山東輕工業(yè)學院碩士學位論文,2009.