大鼠皮膚成纖維細胞分離培養方法的研究

摘要：目的：對大鼠皮膚成纖維細胞進行分離培養并觀察形態。方法：組織塊培養法分離大鼠成纖維細胞并進行傳代培養并通過細胞形態學觀察和HE染色對其細胞進行鑒定。結果體外培養的成纖維細胞呈梭形或多角形，24小時貼壁，通過HE染色，細胞核被染成藍紫色，胞漿被染成粉紅色。結論：該方法成功培養了大鼠背部皮膚的成纖維細胞，所獲得的大鼠背部皮膚成纖維細胞可在體外穩定培養，為一些組織來源較少的成纖維細胞培養提供一種有效且可行的實驗方法。

關鍵詞：大鼠；成纖維細胞；體外培養

中圖分類號： R329.2 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.23.0019

成纖維細胞是真皮組織的主要組成成分，在構建人工皮膚和組織創傷修復中發揮著重要作用，對成纖維細胞的培養研究已經為細胞水平上研究傷口愈合的機制提供了有力工具[1]。本文旨在探索組織塊培養法進行大鼠成纖維細胞分離和體外培養。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

新出生SD大鼠、超凈工作臺、超低溫冰箱、CO2培養箱、眼科剪、培養瓶、離心管、尼龍紗網、乙醇、PBS溶液、新生牛血清、DMEM培養液、中性蛋白酶、胰蛋白酶、血球計數板。

1.2 實驗方法

1.2.1 成纖維細胞的分離與培養 取新出生的SD大鼠，斷頸處死，在75%乙醇中浸泡3～5分鐘。在無菌條件下，剪取大乳鼠背部皮膚。去除皮下組織，PBS溶液反復漂洗后，將組織塊剪切成約1立方毫米的小塊，0.25%中性蛋白酶在4℃處理12～16小時，去除表皮，將剩余的真皮組織以0.3～0.5毫米間距接種于培養瓶內壁，加入少量DMEM培養液，置入5% CO2， 37℃的CO2培養箱中培養24小時，待組織塊吸附牢固后，次日補加培養液至正常體積，三天后換液。當成纖維細胞匯合成片，占培養瓶底面的80%左右時，加入PBS溶液洗滌2次，加入少量0.25%胰蛋白酶覆蓋瓶底，消化3～5分鐘，當細胞間隙變大，胞質回縮時，加入含有小牛血清的培養基終止消化，由上至下，由左至右吹打瓶壁，細胞脫落后，以1200轉/分鐘離心5分鐘，棄上清加入10%小牛血清的DMEM培養基重懸，臺盼藍染色進行細胞計數，按照8×104密度接種培養。當細胞培養至第5代，第10代分別進行常規凍存，以便需要時復蘇。

1.2.2 HE染色 細胞爬片，PBS洗滌，95%酒精固定，PBS洗滌，浸入蘇木精染液，自來水浸洗；浸入稀鹽酸酒精溶液分色，自來水浸洗；浸入淡氨水，使胞核藍化，自來水浸洗；浸入伊紅染液，自來水浸洗；逐級脫水，二甲苯透明，滴加中性樹膠，封固，鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 觀察體外培養的細胞

接種后，4小時左右開始貼壁生長，1～3天游離出的細胞開始貼壁，細胞變為梭形。隨著時間延長，原代培養的細胞匯合成片，7天后長滿單層，細胞伸展呈現梭形和多邊形，體積變大，細胞中央有卵圓形的細胞核，胞質向外伸出2～3個不規則的生長突。細胞在生長時總體呈放射火焰狀或旋渦狀生長。

2.2 HE染色觀察

經過HE染色的細胞，形狀為多角形或長梭形，可見細胞核位于細胞的中央， 細胞核被染成淡藍色，細胞質被染成粉紅色。

3 討論

成纖維細胞是真皮組織的主要構成細胞，不僅可以合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白等多種細胞外成分，還可以分泌一些重要的細胞因子[2]。原代培養常采用酶消化法，但步驟多，過程復雜，并且酶本身對細胞貼壁有一定影響，多次離心也會導致細胞收到損傷和數量丟失，組織塊培養法相對酶消化法步驟簡單，容易掌握，操作過程中不易發生污染，細胞成活率高，簡單易行[3]。本實驗將酶消化法和組織塊法二者結合，使用了溫和的中性蛋白酶，可以將表皮與真皮之間的連接斷開，避免了在細胞培養時混雜有表皮細胞對其生長的干擾，組織塊法對真皮組織進行培養，最大限度地保留了組織中各種生長因子的活性，保留了其對細胞增殖的促進作用。組織塊中含有大量的生長因子，這些生長因子游離出來釋放到培養基中，對細胞的體外生長起積極作用[4]。本實驗分離培養的成纖維細胞絕大多數呈長梭形，胞體細長，有2～3個胞突，細胞折光性強，活力強，HE染色后核質明顯，具有成纖維細胞典型的形態學特征。充分證明該方法培養的成纖維細胞活力強，細胞損失少，且純化效果好，對于一些組織來源較少的成纖維細胞培養提供一種有效且可行的實驗方法。

參考文獻

[1] 陳世義，馬剛，于海濱，等.人工真皮成纖維細胞的分離培養與鑒定[J].吉林大學學報，2002，28 （4） ：437-438.

[2] 李常，葛正行，李波，等.大鼠氣道成纖維細胞的分離、培養及鑒定[J].吉林醫學雜志.2012， 8 （19） ：3-4.

[3] 李海紅，周崗，付小兵，等.人皮膚成纖維細胞的培養和鑒定[J].中國危重病急救醫學，2005，17 （2） ： 89-91.

[4] 王艷.MDA-7基因的腺病毒載體構建及其腫瘤靶向治療的實驗研究， [D].江蘇大學，2008.

作者簡介：馮穎，碩士，通化師范學院生命科學學院，講師，研究方向：生物技術。endprint