大鼠皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的研究

摘要：目的：對(duì)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)并觀察形態(tài)。方法：組織塊培養(yǎng)法分離大鼠成纖維細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和HE染色對(duì)其細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞呈梭形或多角形，24小時(shí)貼壁，通過HE染色，細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，胞漿被染成粉紅色。結(jié)論：該方法成功培養(yǎng)了大鼠背部皮膚的成纖維細(xì)胞，所獲得的大鼠背部皮膚成纖維細(xì)胞可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，為一些組織來源較少的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)提供一種有效且可行的實(shí)驗(yàn)方法。

關(guān)鍵詞：大鼠；成纖維細(xì)胞；體外培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： R329.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.23.0019

成纖維細(xì)胞是真皮組織的主要組成成分，在構(gòu)建人工皮膚和組織創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，對(duì)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)研究已經(jīng)為細(xì)胞水平上研究傷口愈合的機(jī)制提供了有力工具[1]。本文旨在探索組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行大鼠成纖維細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

新出生SD大鼠、超凈工作臺(tái)、超低溫冰箱、CO2培養(yǎng)箱、眼科剪、培養(yǎng)瓶、離心管、尼龍紗網(wǎng)、乙醇、PBS溶液、新生牛血清、DMEM培養(yǎng)液、中性蛋白酶、胰蛋白酶、血球計(jì)數(shù)板。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取新出生的SD大鼠，斷頸處死，在75%乙醇中浸泡3～5分鐘。在無菌條件下，剪取大乳鼠背部皮膚。去除皮下組織，PBS溶液反復(fù)漂洗后，將組織塊剪切成約1立方毫米的小塊，0.25%中性蛋白酶在4℃處理12～16小時(shí)，去除表皮，將剩余的真皮組織以0.3～0.5毫米間距接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁，加入少量DMEM培養(yǎng)液，置入5% CO2， 37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待組織塊吸附牢固后，次日補(bǔ)加培養(yǎng)液至正常體積，三天后換液。當(dāng)成纖維細(xì)胞匯合成片，占培養(yǎng)瓶底面的80%左右時(shí)，加入PBS溶液洗滌2次，加入少量0.25%胰蛋白酶覆蓋瓶底，消化3～5分鐘，當(dāng)細(xì)胞間隙變大，胞質(zhì)回縮時(shí)，加入含有小牛血清的培養(yǎng)基終止消化，由上至下，由左至右吹打瓶壁，細(xì)胞脫落后，以1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清加入10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照8×104密度接種培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第5代，第10代分別進(jìn)行常規(guī)凍存，以便需要時(shí)復(fù)蘇。

1.2.2 HE染色 細(xì)胞爬片，PBS洗滌，95%酒精固定，PBS洗滌，浸入蘇木精染液，自來水浸洗；浸入稀鹽酸酒精溶液分色，自來水浸洗；浸入淡氨水，使胞核藍(lán)化，自來水浸洗；浸入伊紅染液，自來水浸洗；逐級(jí)脫水，二甲苯透明，滴加中性樹膠，封固，鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀察體外培養(yǎng)的細(xì)胞

接種后，4小時(shí)左右開始貼壁生長(zhǎng)，1～3天游離出的細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞變?yōu)樗笮?。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，原代培養(yǎng)的細(xì)胞匯合成片，7天后長(zhǎng)滿單層，細(xì)胞伸展呈現(xiàn)梭形和多邊形，體積變大，細(xì)胞中央有卵圓形的細(xì)胞核，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)不規(guī)則的生長(zhǎng)突。細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)總體呈放射火焰狀或旋渦狀生長(zhǎng)。

2.2 HE染色觀察

經(jīng)過HE染色的細(xì)胞，形狀為多角形或長(zhǎng)梭形，可見細(xì)胞核位于細(xì)胞的中央， 細(xì)胞核被染成淡藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色。

3 討論

成纖維細(xì)胞是真皮組織的主要構(gòu)成細(xì)胞，不僅可以合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白等多種細(xì)胞外成分，還可以分泌一些重要的細(xì)胞因子[2]。原代培養(yǎng)常采用酶消化法，但步驟多，過程復(fù)雜，并且酶本身對(duì)細(xì)胞貼壁有一定影響，多次離心也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞收到損傷和數(shù)量丟失，組織塊培養(yǎng)法相對(duì)酶消化法步驟簡(jiǎn)單，容易掌握，操作過程中不易發(fā)生污染，細(xì)胞成活率高，簡(jiǎn)單易行[3]。本實(shí)驗(yàn)將酶消化法和組織塊法二者結(jié)合，使用了溫和的中性蛋白酶，可以將表皮與真皮之間的連接斷開，避免了在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)混雜有表皮細(xì)胞對(duì)其生長(zhǎng)的干擾，組織塊法對(duì)真皮組織進(jìn)行培養(yǎng)，最大限度地保留了組織中各種生長(zhǎng)因子的活性，保留了其對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。組織塊中含有大量的生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子游離出來釋放到培養(yǎng)基中，對(duì)細(xì)胞的體外生長(zhǎng)起積極作用[4]。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞絕大多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，胞體細(xì)長(zhǎng)，有2～3個(gè)胞突，細(xì)胞折光性強(qiáng)，活力強(qiáng)，HE染色后核質(zhì)明顯，具有成纖維細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)特征。充分證明該方法培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞活力強(qiáng)，細(xì)胞損失少，且純化效果好，對(duì)于一些組織來源較少的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)提供一種有效且可行的實(shí)驗(yàn)方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳世義，馬剛，于海濱，等.人工真皮成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，28 （4） ：437-438.

[2] 李常，葛正行，李波，等.大鼠氣道成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定[J].吉林醫(yī)學(xué)雜志.2012， 8 （19） ：3-4.

[3] 李海紅，周崗，付小兵，等.人皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2005，17 （2） ： 89-91.

[4] 王艷.MDA-7基因的腺病毒載體構(gòu)建及其腫瘤靶向治療的實(shí)驗(yàn)研究， [D].江蘇大學(xué)，2008.

作者簡(jiǎn)介：馮穎，碩士，通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，講師，研究方向：生物技術(shù)。endprint