新型產瓊膠酶海洋細菌的篩選和鑒定

劉麗莉+祖國仁

摘要：從大連沿海的50份石花菜中篩選出相對酶活較高的83株產瓊膠酶菌株（酶活力測定采用3， 5 - 二硝基水楊酸法），挑選瓊膠酶活力最高的菌株并通過形態學特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析研究其分類地位。結果表明，該菌株（暫命名為ZGR-26）為革蘭氏陰性桿菌，與食瓊膠弧菌（Vibrio agarivorans）序列同源性達到99%，兩者生理生化特性基本相符，可初步確定為食瓊膠弧菌（Vibrio agarivorans）。篩選得到了新型的產瓊膠酶海洋細菌——食瓊膠弧菌（Vibrio agarivorans），分泌瓊膠酶活力較高（32.1 U/mL），為微生物降解法生產瓊膠寡糖提供了新的出發菌株。

關鍵詞：瓊膠酶;篩選與鑒定;16S rRNA;食瓊膠弧菌（Vibrio agarivorans）

中圖分類號：Q939 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4831-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.015

Screening and Identification of A Novel Marine Bacterium Producing Agarase

LIU Li-li， ZU Guo-ren

（ School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China）

Abstract： 83 agarase-producing strain with high enzyme activity were screened from 50 samples of Gelidium in Dalian coast by DNS method. The morphology， physiological characteristics and 16SrRNA sequence of the strains were identified to characterize its classification status. The results showed that the strain （named as ZGR-26） was Gram negative bacilli， had 99% homology and consistent physiological and biochemical characteristics with Vibrio agarivorans. The screened novel marine agarase-producing bacteria was identified as Vibrio agarivorans. The activity of producing agarase reached to 32.1 U/mL. It will provide a initial strain to agar- oligosaccharides manufacture by bio-degradation.

Key words： agarse; screening and identification;16SrRNA;Vibrio agarivorans

瓊脂又稱瓊膠，是一組海藻多糖的總稱，由半乳糖和3，6—內醚—L-半乳糖通過1—3和1—4糖苷鍵交替連接的長鏈，在C6上被硫酸酯化，是一類含硫酸酯的半乳聚糖[1]。天然瓊膠是一種從海洋藻類細胞壁中提取出來的多糖，其水解產物瓊膠低聚糖或瓊膠寡糖在食品和醫藥領域應用廣泛。瓊膠寡糖不受腸道內細菌分解以及無熱量產生，因而可作高甜味劑的填充劑及分散劑用于飲料、面包及低熱量食品的生產[2]。瓊膠寡糖通過阻止可誘導性NO合成酶（iNOS）的表達來抑制過量NO自由基的產生，從而消除一些因NO過量而造成的關節炎等炎癥[3]。此外瓊膠低聚糖ML對自由基有很好的清除作用，小鼠試驗表明中分子瓊膠低聚糖（ML）可保護抗氧化酶SOD和GSH—Px的活力，對肝損傷有良好的保護作用[4]。目前瓊膠寡糖的獲取途徑主要是通過化學降解法和酶解法，化學降解法存在條件難控制、產物不均一、產物分析和回收難等問題。用微生物分泌的瓊膠酶水解瓊膠制備瓊膠寡糖，不僅反應條件溫和，能耗低，且酶催化具有高效性和專一性，選擇性地切斷糖苷鍵，可克服化學降解法存在的問題[5]。

目前絕大部分瓊膠酶來源于海洋生態系統中的海洋細菌，這類微生物分布范圍非常廣且其產酶量大。劉江濤等[6]從江蘺中分離得到了兩株多食鞘氨醇桿菌;田國強等[7]發現紅藻門江蘺和石花菜中共生有Agarivorans、Cellulophaga、Alteromonas、Saccharophagus、Glaciecola、Vibrio 6個屬的具有降解瓊膠能力的海洋細菌;除了在海洋生態系統以外，降解瓊膠的菌類也同樣存在陸地生態系統中，Suzuki 等[8]在日本岐阜地區的土壤中分離到一株能夠產生α-新瓊寡糖水解酶的芽孢桿菌（Bacillus sp.MK03） 。這些已發現的海洋細菌降解瓊膠能力普遍偏低，還遠未能達到工業化生產瓊膠寡糖的需求，這也成為阻礙生物法制備瓊膠寡糖的瓶頸，本研究從海洋微生物中分離出高效降解瓊膠的菌株，為今后開發利用海洋細菌細胞內的多糖降解酶和對應的功能基因生產功能性寡糖奠定基礎;同時，為進一步研究凝膠的寡糖成分、寡糖活性創造條件。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株來源 ?大連黑石礁沿海海域自然生長的石花菜。分離培養基（2216E）：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高鐵0.01 g，瓊脂20 g，陳海水1 000 mL，pH 7.2～7.8，121 ℃，20 min 滅菌后倒平板。種子培養基：瓊脂1 g，其他成分同分離培養基。發酵培養基：同種子培養基。

1.1.2 ?主要試劑及儀器 ?瓊脂及其他化學試劑均來自北京奧博星生物技術有限責任公司。JSM-460LV型掃描電鏡（英國牛津儀器公司），722型光柵分光光度計（上海分析儀器廠）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?產瓊膠酶海洋細菌的分離 ?將采集的50份石花菜樣品用剪刀將其剪成細小碎片，置于含有玻璃珠的海水中振蕩30 min，取不同稀釋梯度的菌懸液涂布在分離培養基，28 ℃培養觀察。以能產生瓊脂凹陷圈為標準，挑取凹陷圈較大的菌株，單菌落斜面保藏以篩選產瓊膠酶性能優良菌株。

1.2.2 ?產瓊膠酶性能優良菌株的篩選 ?挑取篩選菌株一環，接入裝有5 mL種子培養基的大試管中， 28 ℃，150 r/min搖床培養24 h后，轉接到裝有30 mL/100 mL發酵培養基的三角瓶中，28 ℃，150 r/min搖床培養48 h，取培養液于8 000 r/min離心5 min后，上清液以DNS法（3， 5 - 二硝基水楊酸法）[9]測量瓊膠酶活力。DNS法瓊膠酶活力測定方法：取1 mL發酵上清液和1 mL磷酸緩沖液（瓊脂0.2 g/L，pH 7.0）于試管內，于40 ℃溫浴30 min后加入2mL DNS試劑，混合液在沸水中水浴10 min后用去離子水定容至25 mL，充分混勻后在540 nm處測量吸光度值。酶活力定義：以煮沸滅活的上清液為空白對照，以1 mL酶液1 min產1 μg還原糖定義為1個活力單位。

1.2.3 ?產瓊膠酶海洋細菌的電鏡形態觀察 ?電子掃描電鏡觀察細胞形態。

1.2.4 ?產瓊膠酶海洋細菌鑒定 ?菌株的形態學和生理生化特性的測定： 根據《常見細菌系統鑒定手冊》所列菌種鑒定的方法進行菌種的鑒定[10]。菌株的16S rRNA基因序列測定和分析： ① 16S rRNA基因序列測定：由寶生物工程有限公司完成。②16S rRNA基因序列結果分析：將所得到的基因序列利用BLAST軟件與GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫進行序列比對， 獲取相近典型菌株的16S rRNA基因序列， 采用ClustalX和MEGA軟件包進行分析， 用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹， 進行系統發育分析， 各枝上的數字是1 000次Bootstrap重抽樣分析的支持百分比[11-13]。

2 ?結果

2.1 ?細菌分離結果

從50份石花菜樣本中分離得到83株菌株，根據瓊脂凹陷圈大小得到具有較明顯分解瓊脂能力的菌株30株（圖1A），經盧哥氏碘液染色后產生透明圈（圖1B）。

2.2 ?高產瓊膠酶菌株的篩選

以初步分離得到的30株菌株為出發菌株，測得其48 h瓊膠酶活力（表1）。其中酶活力平均值在10以上的菌株有15株，酶活力最高菌株為ZGR-26菌株，達到32.1。由于這些菌株的菌落形態較為相似，認為是同一種菌，所以選取產酶活力最高的ZGR-26菌株進行鑒定。

2.3 ?產瓊膠酶菌株ZGR-26的形態、培養特征及理化特性

瓊膠酶產生菌ZGR-26在2216E固體培養基培養48 h后觀察， 菌落呈扁圓形凸起， 光滑， 比較濕潤， 白色或淡黃色，透明，邊緣整齊， 無可溶性色素， 周邊分解瓊脂產生透明凹陷。電鏡觀察， 細胞短桿狀，（1.0～1.5） μm×（1.5～2.0） μm， 無芽孢， 革蘭氏染色陰性（圖2）。

ZGR-26的部分生理生化特征見表2。將該菌株與V. agarivorans進行生理生化特征鑒定比較， 結果表明菌株ZGR-26所測定的生理生化反應與V. agarivorans作為屬間種的鑒別的特征基本相符（但是ZGR-26能利用蔗糖作為碳源，而V. agarivoran則不能），由此初步鑒定該菌為食瓊膠弧菌。

2.4 ?16S rRNA基因序列分析

將擴增得到的16S rRNA基因片段電泳檢測， 測得其序列長度為1 458 bp。經BLASTn軟件序列分析， 結果表明細菌ZGR-26 （KF612972）與食瓊膠弧菌（V. agarivorans）同源性最高（表3）。從GenBank中選取和菌株ZGR-26同源性較高的8株菌株的16S rRNA基因序列構建系統發育進化樹， 結果顯示，ZGR-26的遺傳進化距離與食瓊膠弧菌（V. agarivorans）最近， 并在同一分支中，而與此前發現較多的噬瓊膠菌（Agarivorans albus）進化距離較遠，不在同一進化分支中（圖3）。根據菌株的形態學特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析， 初步鑒定細菌ZGR-26為食瓊膠弧菌（V. agarivorans）。

3 ?討論

國內外對于能降解瓊膠的海洋細菌的研究主要集中在噬瓊膠菌（Agarivorans albus）上，其中從榮螺腸道中分離得到的噬瓊膠菌株瓊膠酶基因已經被測定出來，并在宿主大腸桿菌中得到成功表達[14]。本試驗從石花菜中篩選得到了30株菌株的瓊膠酶活力，其中菌株ZGR-26酶活力達到32.1。經16S rRNA基因序列分析表明，與已報道有明顯降解瓊脂能力的噬瓊膠菌（Agarivorans albus）進化距離較遠，而與食瓊膠弧菌（V. agarivorans）最為接近。菌株生理生化特征結果表明ZGR-26除了在利用蔗糖能力上與食瓊膠弧菌有所差別，其他特征基本一致，可以確定ZGR-26為食瓊膠弧菌（V. agarivorans）。此類瓊膠降解菌國內首次發現，國外僅Macisn等[15]從大西洋海水及蚌類中分離出食瓊膠弧菌（V. agarivorans），這為微生物生態多樣性研究奠定了基礎，這也為生物制備瓊膠寡糖提供了更為廣泛的研究材料，為大量制備高純度的低聚糖創造條件，在寡糖的基礎及應用研究方面提供技術支撐，以及為海洋寡糖類創新藥物的研究開發以及其相關產業的發展奠定理論基礎，對推動糖生物學和化學研究的深入開展具有重要意義。

參考文獻：

[1] 郭彥岑，尹群健，卓書輝，等.瓊膠酶高產細菌的分離及鑒定[J]. 西北師范大學學報（自然科學版），2012，48（6）：76-81.

[2] 繆伏榮，李忠榮.瓊膠的降解及其產物的開發應用[J].現代農業科技，2007（2）：125-128.

[3] 劉江濤，蔡俊鵬，吳 ?冰.瓊膠酶及其綜合應用的研究概況[J].現代食品科技，2005，21（1）：177-179.

[4] 薛長湖，徐 ?強，趙 ?雪.瓊膠低聚糖清除自由基的活性[J].水產學報，2003，27（3）：283-288.

[5] 問莉莉，董靜靜，李思東. 瓊膠寡糖的制備及其應用研究進展[J] .山東化工，2011（40）：28-30.

[6] 劉江濤，蔡俊鵬，吳 ?冰.兩株瓊膠酶高產細菌的篩選和鑒定[J] .現代食品科技，2005，21（1）：43-45.

[7] 呂國強，苗婷婷，邢 ?翔.海洋瓊膠降解細菌的篩選及HQM9瓊膠酶研究[J].海洋湖沼通報，2011（4）：33-39.

[8] SUZUKI H， SAWAI Y， SUZUKIT. Purification and characterization of an extracellular alpha-neoagarooligosaccharide hydrolase from Bacillus sp. MK03[J]. J Biosci Bioeng，2002，93（5）： 456-463.

[9] 王曉燕，桑衛國.SPSS正交設計優化瓊膠酶產生菌的發酵條件[J].寧波大學學報（理工版），2010，23（2）：11-16.

[10] 東秀珠，蔡秒英.常見細菌系統鑒定手冊[M].第一版.北京：科學出版社，2001.

[11] MA Y X， LIU X G， GAO K X， et al. Preliminary study on biocontrol potential of Rhizobacterium Serratia plymu-thica HRO-C48（in Chinese） [J]. Journal of Yun-nan Agricultural University， 2007， 22（1）： 49-53.

[12] KAMENSKY M， OVADIS M， CHET I， et al. Soil-borne strain IC14 of Serrartia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases[J]. Soil Bioc-hemistry， 2003， 35（2）： 323-331.

[13] MEZIANE H， GAVRIEL S， ISMAILOV Z， et al. Control of green and blue mould on orange fruit by Serratia plymuthi-ca strains IC14 and IC1270 and putative modes of action[J]. Postharvest Biology and Technology， 2006， 39（2）： 125-133.

[14] 付曉婷.海洋細菌（Agarivorans albus YKW-34）產生的褐藻膠裂解酶及瓊膠酶的研究[D].山東青島：中國海洋大學，2008.

[15] MACISN M C ， LUDWING W， SCHLEIFER K H. Vibrio agarivorans sp. nov.，a novel agarolytic marine bacterium[J].Systematic and Evolutionary，2001，51：2031-2036.

參考文獻：

[1] 郭彥岑，尹群健，卓書輝，等.瓊膠酶高產細菌的分離及鑒定[J]. 西北師范大學學報（自然科學版），2012，48（6）：76-81.

[2] 繆伏榮，李忠榮.瓊膠的降解及其產物的開發應用[J].現代農業科技，2007（2）：125-128.

[3] 劉江濤，蔡俊鵬，吳 ?冰.瓊膠酶及其綜合應用的研究概況[J].現代食品科技，2005，21（1）：177-179.

[4] 薛長湖，徐 ?強，趙 ?雪.瓊膠低聚糖清除自由基的活性[J].水產學報，2003，27（3）：283-288.

[5] 問莉莉，董靜靜，李思東. 瓊膠寡糖的制備及其應用研究進展[J] .山東化工，2011（40）：28-30.

[6] 劉江濤，蔡俊鵬，吳 ?冰.兩株瓊膠酶高產細菌的篩選和鑒定[J] .現代食品科技，2005，21（1）：43-45.

[7] 呂國強，苗婷婷，邢 ?翔.海洋瓊膠降解細菌的篩選及HQM9瓊膠酶研究[J].海洋湖沼通報，2011（4）：33-39.

[8] SUZUKI H， SAWAI Y， SUZUKIT. Purification and characterization of an extracellular alpha-neoagarooligosaccharide hydrolase from Bacillus sp. MK03[J]. J Biosci Bioeng，2002，93（5）： 456-463.

[9] 王曉燕，桑衛國.SPSS正交設計優化瓊膠酶產生菌的發酵條件[J].寧波大學學報（理工版），2010，23（2）：11-16.

[10] 東秀珠，蔡秒英.常見細菌系統鑒定手冊[M].第一版.北京：科學出版社，2001.

[11] MA Y X， LIU X G， GAO K X， et al. Preliminary study on biocontrol potential of Rhizobacterium Serratia plymu-thica HRO-C48（in Chinese） [J]. Journal of Yun-nan Agricultural University， 2007， 22（1）： 49-53.

[12] KAMENSKY M， OVADIS M， CHET I， et al. Soil-borne strain IC14 of Serrartia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases[J]. Soil Bioc-hemistry， 2003， 35（2）： 323-331.

[13] MEZIANE H， GAVRIEL S， ISMAILOV Z， et al. Control of green and blue mould on orange fruit by Serratia plymuthi-ca strains IC14 and IC1270 and putative modes of action[J]. Postharvest Biology and Technology， 2006， 39（2）： 125-133.

[14] 付曉婷.海洋細菌（Agarivorans albus YKW-34）產生的褐藻膠裂解酶及瓊膠酶的研究[D].山東青島：中國海洋大學，2008.

[15] MACISN M C ， LUDWING W， SCHLEIFER K H. Vibrio agarivorans sp. nov.，a novel agarolytic marine bacterium[J].Systematic and Evolutionary，2001，51：2031-2036.

參考文獻：

[1] 郭彥岑，尹群健，卓書輝，等.瓊膠酶高產細菌的分離及鑒定[J]. 西北師范大學學報（自然科學版），2012，48（6）：76-81.

[2] 繆伏榮，李忠榮.瓊膠的降解及其產物的開發應用[J].現代農業科技，2007（2）：125-128.

[3] 劉江濤，蔡俊鵬，吳 ?冰.瓊膠酶及其綜合應用的研究概況[J].現代食品科技，2005，21（1）：177-179.

[4] 薛長湖，徐 ?強，趙 ?雪.瓊膠低聚糖清除自由基的活性[J].水產學報，2003，27（3）：283-288.

[5] 問莉莉，董靜靜，李思東. 瓊膠寡糖的制備及其應用研究進展[J] .山東化工，2011（40）：28-30.

[6] 劉江濤，蔡俊鵬，吳 ?冰.兩株瓊膠酶高產細菌的篩選和鑒定[J] .現代食品科技，2005，21（1）：43-45.

[7] 呂國強，苗婷婷，邢 ?翔.海洋瓊膠降解細菌的篩選及HQM9瓊膠酶研究[J].海洋湖沼通報，2011（4）：33-39.

[8] SUZUKI H， SAWAI Y， SUZUKIT. Purification and characterization of an extracellular alpha-neoagarooligosaccharide hydrolase from Bacillus sp. MK03[J]. J Biosci Bioeng，2002，93（5）： 456-463.

[9] 王曉燕，桑衛國.SPSS正交設計優化瓊膠酶產生菌的發酵條件[J].寧波大學學報（理工版），2010，23（2）：11-16.

[10] 東秀珠，蔡秒英.常見細菌系統鑒定手冊[M].第一版.北京：科學出版社，2001.

[11] MA Y X， LIU X G， GAO K X， et al. Preliminary study on biocontrol potential of Rhizobacterium Serratia plymu-thica HRO-C48（in Chinese） [J]. Journal of Yun-nan Agricultural University， 2007， 22（1）： 49-53.

[12] KAMENSKY M， OVADIS M， CHET I， et al. Soil-borne strain IC14 of Serrartia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases[J]. Soil Bioc-hemistry， 2003， 35（2）： 323-331.

[13] MEZIANE H， GAVRIEL S， ISMAILOV Z， et al. Control of green and blue mould on orange fruit by Serratia plymuthi-ca strains IC14 and IC1270 and putative modes of action[J]. Postharvest Biology and Technology， 2006， 39（2）： 125-133.

[14] 付曉婷.海洋細菌（Agarivorans albus YKW-34）產生的褐藻膠裂解酶及瓊膠酶的研究[D].山東青島：中國海洋大學，2008.

[15] MACISN M C ， LUDWING W， SCHLEIFER K H. Vibrio agarivorans sp. nov.，a novel agarolytic marine bacterium[J].Systematic and Evolutionary，2001，51：2031-2036.