經皮電針刺激正常人耳甲迷走神經的功能MRI腦效應研究

方繼良，洪洋，范洋洋，劉軍，馬云遙，徐春華，王鴻紅，馬迎歌，王小玲，劉志順，朱兵，孔健，榮培晶*

1.中國中醫科學院廣安門醫院放射科腦功能成像研究室，北京 100053

2.中國中醫科學院廣安門醫院針灸科，北京 100053

3.北京中醫藥大學護國寺中醫院針灸科，北京 100035

4.中國中醫科學院針灸研究所，北京100700

5.美國哈佛醫學院麻省總醫院瑪蒂魯斯生物醫學成像中心，MA02129，美國

迷走神經刺激術(vagus nerve stimulation，VNS)是近20年來興起的用于治療某些頑固性疾病的物理治療方法，對原發性高血壓、糖尿病、藥物抵抗型癲癇及抑郁癥有一定的療效，美國FDA先后批準了VNS可作為難治性癲癇及抑郁癥的一種可行療法[1]。此療法通過手術在頸部放置刺激器，刺激左側頸部迷走神經干，達到治療效應。盡管此技術很有前途，但也存在費用高，手術有產生副作用風險，還將會對患者病情產生消極影響[2]。2000年，Ventureyra[3]提出了經皮刺激迷走神經的概念(transcutaneous VNS，tVNS)，通過外耳道刺激產生“迷走神經效應”，國內朱兵課題組近10年來進行了經耳甲迷走神經經皮刺激術系列研究，初步表明對頑固性癲癇、血壓調控、血糖改善、緩解失眠、抑郁癥狀等多種病變有確切療效，還具有操作簡單、成本低廉、安全無創等優點，具有廣闊的臨床應用前景。但其效應的腦機制尚待闡明[4-8]。

本研究采用fMRI技術，經皮電刺激正常人右側耳甲部迷走神經分布區，觀察包括腦干的全腦血流動力學即時效應，分析腦功能激活區及負激活區的變化。提出耳甲部迷走神經刺激技術調制孤束核-邊緣葉腦網絡的假說。以此為探討耳迷走神經刺激術治療疾病的腦機理打下基礎，為耳迷走神經刺激術替代手術植入性迷走神經刺激治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗共錄入16名健康志愿者，男9名，女7名，平均年齡23.8歲(18～27歲)，均為右利手，受試前3 d無任何藥物服用史，身體健康,無神經精神病史及頭部外傷史。實驗通過了廣安門醫院倫理委員會批準，實驗前每位受試者均填寫知情同意書、MRI檢查問卷，均無MR掃描禁忌證。

1.2 研究內容

(1)正常人組經皮電刺激耳甲迷走神經的fMRI腦效應；(2)正常人組上耳舟部對照電刺激的fMRI腦效應。

1.3 研究方法

經皮耳迷走神經刺激方法(圖1)：參照耳部迷走神經解剖，耳迷走神經支從外耳道后外下方進入耳廓之處的耳甲腔區，解剖學定位為外耳道后外下方，此區在耳穴腎上腺點與氣管點交叉的下方，暫命名為“迷走”穴。選取右側耳甲部及外耳道作為迷走刺激組，耳廓外耳緣中部，即上耳舟部作為對照刺激點。采用電磁屏蔽的銅導線，其遠端為自制約5 mm直徑圓形錫片電極，用小透明膠條固定兩電極，在同一區域內黏貼約相隔2 cm。電磁屏蔽線連接磁共振室門外的華佗牌經皮儀(TENS-200，中國中醫科學院針灸研究所與蘇州醫療用品廠有限公司聯合研制)，其為恒壓，電流連續輸出，脈沖為連續波，頻率為20 Hz，波寬0.2 ms，電刺激強度為患者能耐受而不致產生痛覺的痛閾下電流，此電流在掃描實驗前當時測定，一般為4～8 mA。正常人刺激與對照實驗順序為均衡設計(隨機錄入16例受試者，第一受試者先接受迷走刺激實驗，那么下一受試者先接受對照部位刺激實驗，同一受試者兩次實驗間隔7 d)。

圖1 耳部經皮試驗示意圖。紅色：迷走刺激區 tVNS 經皮迷走神經刺激；蘭色：對照刺激區 stVNS經皮非迷走神經刺激組Fig.1 Auricular point.Red color tVNS:tVNS on ACR.Blue color stVNS:sham tVNS on the superior scapha.

fMRI掃描方法：預先告知受試者試驗過程及注意事項，解釋經皮電刺激感覺的分類和強度主觀評判方法，保證每一受試者得到相同的指令和信息。被試者在恒溫(24 ℃)完全休息30 min后，平臥在檢查床上，視聽封閉條件下閉眼安靜時掃描，先采集高清3D解剖像，然后，每個實驗部位粘連電極，先試電流量，以能忍受而不產生尖銳性疼痛為度。然后間斷通電6 min時行EPI-fMRI掃描，重復任務掃描一次(圖2)。

圖2 fMRI掃描的刺激模式圖。A：不通電；B：通電刺激S1、S2、S3Fig.2 fMRI block design paradigm.A:current off.B:current on S1,S2,S3.

使用GE1.5 T Signa Excite ⅡMRI掃描儀，頭部正交線圈。3D解剖T1 FSPGR參數： 矩陣256×192，FOV 200 mm×200 mm,層厚 1.4 mm，反轉角15°；EPI- fMRI圖像數據的采集參數：TR 2500 ms，TE 30 ms，矩陣64×64，NEX為1，FOV 240 mm×240 mm，層厚3.0 mm，層間距0.5 mm，41層，反轉角90°，全腦橫斷掃描，平行于AC-PC線,包括小腦和腦干，每次掃描前空掃4次。

fMRI試驗組塊設計(圖2)。受試者心理行為反應實時記錄：預先測定并記錄最大電流量，掃描完成時馬上要求受試回答，由實驗者記錄每一志愿者的感覺及評分。根據美國麻省總院針刺試驗針感記錄表MASS[9]確定得氣感覺，包括：酸痛、壓感、酸、沉、脹、熱、涼、麻木、麻刺、鈍痛，另外也記錄尖銳性疼痛和其他不適感。0分為無感覺，1～3分為輕度，4～6分中度，7～9分重度，10分為最大可忍受或不可忍受針感。迷走刺激及對照刺激時，均觀察記錄每分鐘的心率及呼吸頻率。感覺數據的統計分析：采用SPSS 19.0軟件處理數據。兩樣本配對t檢驗比較耳甲部及上耳舟部電流量，配對卡方檢驗針感頻率差異，Wilcoxon Signed Ranks 檢驗此兩組的針感強度變化。fMRI數據處理和分析：采用SPM8圖像處理分析軟件分析數據，一般線性模型(GLM)方法：預處理包括realignment，normalization,smoothing，ART 技術被用來去除移動及全腦平均信號(http://web.mit.edu/swg/software.htm)。然后行個體及組分析比較。第一級分析包括迷走及對照刺激個體分析。第二級分析包括組分析及組間比較，共包括迷走刺激組、對照刺激組、迷走-對照刺激組。

重點分析感興趣腦區部位、腦干的孤束核、三叉神經核、邊緣葉系統，包括杏仁核(Amyg)、海馬回(HP)、旁海馬回(ParaPH)；額葉內側回(BA10/11 medial)，扣帶回前部(ACC)、前下部(BA24/32、BA25)、頂葉內側回(Precuneus，BA7 medial)、扣帶后部(BA23，31)。另外還觀察體感Ⅰ區、Ⅱ區、島葉、丘腦、扣帶回中部、腦干籃斑核及網狀結構、小腦蚓部等。

2 結果

2.1 行為學數據-針刺穴位電流量及針感比較

15名受試者fMRI數據參加分析(1例數據因不全排除在統計分析之外)，平均年齡(23.9±3.5)歲，迷走及對照部刺激電流量為(6.47±0.54)mA、(6.87±0.41)mA，(t=－0.685，P=0.505)， 未見顯著性差異。迷走刺激及對照刺激時，心率及呼吸頻率均未發現明顯異常變化，掃描后詢問受試者，均未訴及胸部不適感。

正常人不同耳部兩組間電刺激頻率相似分布，順序為麻刺、麻木、脹滿、壓感、熱感、沉重、酸痛、鈍痛、涼感；組間比較未見明顯差異(P＞0.05)。

電刺激強度兩組均依次由高到低的順序為麻刺、麻木、酸痛、脹滿、熱感、壓感、沉重、鈍痛，組間比較未見明顯差異(P＞0.05)。

2.2 腦血流動力學變化(BOLD-fMRI信號變化)及其對比分析

正常人經皮電刺激迷走、對照部的腦激活、負激活區域分布及差異(表1，2；圖3～5)：16例正常受試者(1例因數據不全，未作納入分析)。因每次實驗均重復掃描一次任務態，每組分別累加得30個組塊序列掃描，均納入迷走及對照組對比分析。

2.2.1 耳甲部迷走刺激的腦功能變化(圖3，4)

表2 迷走電刺激與對照組腦效應比較圖(15名志愿者，每組30個實驗,P＜0.005；體素閾值＞3 voxel )Tab.2 Comparison between signal in tVNS and Sham(30 runs,15subjects,P＜0.005,20 voxel)

負激活區：廣泛而較強的負激活腦區。延髓部負激活區相當于左側孤束核位置；大腦部主要分布于頂上回BA7(precuneus)，前中央回BA4；邊緣葉系統：后扣帶回BA31、23、29、30，雙側顳極BA38及下顳回BA20，雙側下丘腦、旁海馬回，海馬和杏仁核，左側腹內側前額葉BA10。另外可見于前輔助運動皮層BA6內側部，小腦。激活區：主要位于左側體感Ⅱ區，雙側頂葉下回BA40，右顳上回，左側島葉前部，額下外側回BA44、BA47及額極部。

2.2.2 對照部電刺激腦功能變化(圖5)

負激活區：中腦右側三叉神經感覺核、右腦橋核。右頂楔葉、雙側顳極、顳下葉；重要的邊緣葉區域：前、中、后扣帶回BA24、32、23區。左枕葉BA18區、右前額葉及額上葉、左小腦。 激活區：較廣泛而強的激活區，可見于左側SⅡ、雙側頂下回BA40區、額下回BA46區、右側額下回BA44區、顳上回BA42區、左側額中回內側部BA8、前中央回BA6區外側部、緣上回BA40。

2.2.3 兩組間比較結果(表2)

迷走刺激產生了更強的信號，主要位于右島葉、右中腦核臨近錐體束及黑質部位、右枕葉視區、左顳極、右上額葉BA6、小腦。

3 討論

近年來，植入性迷走神經刺激術(invasive VNS,iVNS)已成為藥物抵抗型癲癇及抑郁癥的有效治療方法[1]。但是，因其需要手術，手術存在一定的風險及不良反應，使其推廣受到限制[2]。新近發展的經耳迷走神經刺激技術(tVNS)，在動物及人體實驗中，已發現具有iVNS相似的效應[6，8-9]。但是，腦中樞神經通路及其效應上需得到證實，才可能使其發展成為一門臨床可能替代iVNS的治療新技術。

圖3 tVNS全腦激活及負激活圖 圖4 tVNS產生了腦干孤束核明顯負激活效應。藍色為負激活，NTS：孤束核；PCC：后扣帶回 圖5 對照部電刺激產生了三叉神經中腦核明顯負激活效應。藍色為負激活，1：左側三叉神經中腦核；2：中扣帶回；3：前楔回；5：右旁海馬。紅色為激活，4：額上回(BA8)Fig.3 Map of tVNS eliciting the deactivation and activation in the brain.Fig.4 tVNS eliciting the deactivation in the nucleus of tract solitary in brainstem.Blue color means deactivation.NTS:nucleus of tract solitary.PCC:posterior cingulate cortex.Fig.5 sham tVNS elicited the deactivation in the nucleus of trigeminal nerve in the mid brainstem.Blue color means deactivation.1:nucleus of trigeminal nerve.2:MCC(middle cingulate cortex).3:precuneus.5:parahippocampus.Red color means activation.4:superior frontal gyrus(BA8).

3.1 經皮電刺激耳部感覺分析

針灸理論及臨床實踐表明，耳部具有較多的穴位，針刺穴位時產生的得氣針感，是一種特別的復合感覺，常包括酸麻脹重等多種成分。在既往的正常人體針研究中，發現不同體部7個穴位對電針針感頻率、強度相似，脹滿、麻木和酸感最常見和最明顯，沉重、壓感和麻刺次之[10]。本實驗發現耳甲迷走點及耳廓外緣電刺激感覺相似，麻刺、麻木、脹滿感最為常見。在神經分布來說，耳甲部以迷走神經、耳大神經分布為主，而耳廓部主要由耳大神經分布，神經分布存在明顯的交叉重疊[11]，耳部不同位置具有相似的感覺符合感覺神經生理學原理。電生理研究表明，不同類型的神經纖維傳導的主要感覺不同，如酸痛、鈍痛、熱感主要由慢傳導纖維Aδ和C纖維.麻木及麻刺感由 Aβ傳導。但也存在部分交叉重疊現象。我們的結果與既往體針研究不同的可能原因：前者為四肢肌肉穴位手針或經皮刺激，肌肉組織肌梭神經傳導酸痛感。而我們的實驗為耳部穴位的表皮電刺激，對Aβ及皮膚感覺纖維效果較明顯，麻刺及麻木較易產生。

3.2 耳針與tVNS聯系的神經解剖基礎

耳針療法是祖國醫學的重要組成部分，數千年來，已成為具有系統的理論和豐富的臨床實踐經驗的一門學科，但其現代作用機理還不十分清楚。臨床經驗表明，耳針對人體內臟(臟腑)的生理病理功能的調節作用與針刺對迷走神經的調制效應密切相關，如耳針產生的心臟、肺及支氣管，胃腸道的效應明顯與迷走神經調節功能重疊?，F代解剖學認為，迷走神經在外耳有一分支即迷走神經耳支，主要分布于外耳耳甲區，盡管此部位在耳穴中未包括全部內臟器官穴位點，但集中了主要臟腑的耳穴，如心臟、肺及支氣管、胃腸道、內分泌、腦等。示蹤顯影神經形態學研究表明，迷走神經耳支纖維投射到迷走神經上核、孤束核(nucleus of tract solitary，NTS)，還有纖維投射到三叉神經脊束核(TN，spinal nucleus of trigeminal nerve)。這樣，針刺耳甲部的穴位通過刺激迷走神經耳支投射到NTS，之后產生的效應與iVNS效應相似，通過NTS發出的纖維多突觸投射到延髓中部網狀結構、臂旁核、藍斑核、杏仁核、下丘腦、額眶回等的結構，對大腦產生彌散性的影響[11]。

3.4 iVNS腦效應的功能成像研究

近20年來，多種腦功能成像技術迅速發展，如PET、SPECT及BOLD-fMRI已成功應用到侵入性迷走神經刺激療法的腦機理研究中，綜合研究表明，iVNS產生了即時及長期的腦區功能變化效應，主要作用于邊緣葉系統：海馬、旁海馬、杏仁核、下丘腦、前扣帶回及腹內側前額葉、雙側眶額皮層等[12-13]。這些變化的腦區關聯到迷走神經及其投射系統，與神經精神疾病的發生相關，為iVNS在治療癲癇及抑郁中的作用提供了初步的神經解剖依據。

3.5 tVNS的fMRI任務態研究

對于耳部tVNS的腦功能成像研究，目前還不多，只局限于fMRI在正常受試者身上進行，初步觀察了tVNS在左外耳道的即時腦效應，對tVNS的可行性進行了評估，在使用刺激技術的方法上進行了探討[14-16]。

既往tVNS的fMRI研究中，Kraus等[14]2007年首次比較左側外耳道與耳廓中部刺激，在迷走刺激組，發現明顯廣泛的邊緣葉及顳區的負激活區，如雙側杏仁核、旁海馬、楔葉、中顳回、后扣帶回、左海馬；信號增強區為雙側島葉及前中央回、右丘腦及右前扣帶回；在對照組，顯示旁中央葉及右旁海馬區的信號減低，其他區域顯示中央前回及上中額回信號增強。與我們的實驗邊緣葉負激活相似，但我們直接看到了迷走腦干核團-孤束核及對照刺激三叉神經核的負激活現象。最近，Kraus等[15]又進行了左外耳道前后壁刺激比較研究，發現前壁刺激產生了強烈的藍斑核及孤束核的負激活效應。Dietrich等[16]采用左側外耳道刺激4例正常受試者，發現了藍斑核、丘腦、左后扣帶回的激活及伏核的負激活，認為與tVNS抗抑郁及治療情感相關疾病可能有關。本次實驗樣本較前文獻記載明顯增大，達到15人，共計每組30個實驗，得到的結果既證實了既往iVNS及tVNS效應腦功能成像相似的結果，前額葉及邊緣葉系統明顯的負激活，也顯示了在腦干部的明顯負激活效應，這說明耳甲部與迷走初級中樞孤束核直接相關。

3.6 右側迷走神經刺激腦功能成像研究的意義

既往VNS治療的大量基礎及臨床試驗均采用左側迷走神經刺激。其原因是基于右側頸部迷走神經干存在較多的支配心血管下行迷走副交感支所致。在豬癲癇模型上，右側迷走刺激與左側一樣抑制了人工所誘導的脊髓癲癇[17]。在個案報道中，癲癇病人身上也發現右側迷走刺激iVNS得到了較好的療效，而未引起明顯的心血管副作用[18]。目前，功能影像學研究也只局限于左側迷走神經刺激，因此，筆者采用的右耳甲部刺激實驗將幫助進一步了解了迷走刺激在臨床上的可行性，豐富了其機制多角度的研究[19]。

本研究在樣本量上雖然較既往研究多，但還是較小；還需采集病人治療前后的fMRI數據，與臨床指標變化作相關分析，從功能影像上揭示其治療機制。本研究采用fMRI技術，觀察到經耳迷走神經刺激產生了與既往植入性迷走神經刺激相似的腦效應如廣泛的邊緣葉系統負激活，更重要的是，在腦干迷走神經核上觀察到了直接的效應。初步證實了我們的假說“迷走神經刺激術調制孤束核-邊緣葉腦網絡”。

致謝：感謝導師組(朱兵、喻曉春、榮培晶研究員)的指導。

[Reference]

[1]Cristancho P,Cristancho MA,Bahuch GH ,et al.Effectiveness and safety of vagus nerve stimulation for severe treatment- resistant major depression in clinical practice after FDA approva l:outcomes at 1 year.J Clin Psychiatry,2011,72(10):1376-1382.

[2]Spuck S,Tronnier V,Orosz I,et al.Operative and technical complications of vagus nerve stimulator implantation.Neurosurgery,2010,67(2):489-494.

[3]Ventureyra EC.Transcutaneous vagus nerve stimulation for partial onset seizure therapy:a new concept.Childs Nerv Syst,2000,16(2):101-102.

[4]Zhang JL,He MX,Zhang HQ.Current status and future prospects of vagus nerve stimulation for epilepsy.Chin J Pathophy,2005,21(11):2282-2285.張建梁,何敏賢,張宏啟.迷走神經電刺激治療癲癇的現狀與展望.中國病理生理雜志，2005,21(11):2282-2285.

[5]Gao XY,Li YH,Liu K,et al.Acupuncture-like stimulation at auricular point heart evokes cardiovascular inhibition via activating the cardiacrelated neurons in the nucleus tractus solitaries.Brain Research,2011,1397:19-27.

[6]Liu K,Li L,Ben H,et al.Effect of Electroacupuncture on Electrical Activities of Pressor Refl ex Related Neurons in the Nucleus of Tractus Solitarii(NTS)in Rats.Acupuncture Research,2012,37(3):211-217.劉坤,李亮,賁卉,等.電針大鼠耳穴“心”等對孤束核升壓反射相關神經元電活動的影響 .針刺研究,2012,37(3):211-217.

[7]Huang F,Rong Pj,Wang HC,et al.Clinical observation on the intervention of auricular vagus nerve stimulation treating 35 cases of impaired glucose tolerance patients.Chin J Tradit Chin Med Pharmacy,2010,25(12):2185-2187.黃鳳,榮培晶,王宏才,等.耳甲迷走神經刺激干預35例糖耐量受損患者臨床觀察.中華中醫藥雜志,2010,25(12):2185-2187.

[8]He W,Zhao CL,LI YH,et al.Effect of electroacupuncture at auricular concha on behaviors and electroencephalogram in epileptic rats.Chin J Pathophy,2011,27(10):1913-1916.何偉,趙長龍,李艷華,等.電針耳甲對癲癇大鼠行為學和腦電圖的影響.中國病理生理雜志,2011,27(10):1913-1916.

[9]Fallgatter AJ,Neuhauser B,Herrmann MJ,et al.Far fi eld potentials from the brain stem after traNScutaneous vagus nerve stimulation.J Neural Transm,2003,110(12):1437-1443.

[10]Zhou K,Fang J,Wang X,et al.Characterization of Deqi with electroacupuncture at acupoints with different properties.J Altern Complement Med,2011,17(11):1007-1013.

[11]Standring S.Gray’s Anatomy,The anatomical basis of clinical practice(Translator:Xu Qunyuan,et al).The 39th Edition.Beijing:Peking University medical press,2008:381-409.Standring S.格氏解剖學(Gray Anatomy：臨床實踐的解剖學基礎)(徐群淵譯).39版.北京大學醫學出版社,2008:381-409.

[12]Henry TR,Bakay RA,Votaw JR,et al.Brain blood fl ow alterations induced by therapeutic vagus nerve stimulation in partial epilepsy:I.Acute effects at high and low levels of stimulation.Epilepsia,1998,39(9):983-990.

[13]Conway CR,Chibnall JT,Gebara MA,et al.Association of cerebral metabolic activity changes with vagus nerve stimulation antidepressant response in treatment-resistant depression.Brain Stimul,2013,6(5):788-797.

[14]Kraus T,H?sl K,Kiess O,et al.BOLD fMRI deactivation of limbic and temporal brain structures and mood enhancing effect by transcutaneous vagus nerve stimulation.J Neural Transm,2007,114(11):1485-1493.

[15]Kraus T,Kiess O,H?sl K,et al.CNS BOLD fMRI effects of shamcontrolled transcutaneous electrical nerve stimulation in the left outer auditory canal:a pilot study.Brain Stimul,2013,6(5):798-804.

[16]Dietrich S,Smith J,Scherzinger C,et al.A novel transcutaneous vagus nerve stimulation leads to brainstem and cerebral activatioNS measured by functional MRI.Biomed Tech(Berl),2008,53(3):104-111.

[17]Tubbs RS,Salter EG,Killingsworth C,et al.Right-sided vagus nerve stimulation inhibits induced spinal cord seizures.Clin Anat,2007,20(1):23-26.

[18]Navas M,Navarrete EG,Pascual JM,et al.Treatment of refractory epilepsy in adult patients with right-sided vagus nerve stimulation.Epilepsy Res,2010,90(1-2):1-7.

[19]Zang YF.Problems in manuscripts of clinical studies of functional magnetic resonance imaging.Chin J Magn Reson Imaging,2011,2(5):373-376.臧玉峰.功能磁共振成像臨床應用研究論文審稿中常見的問題.磁共振成像,2011,2(5):373-376.