一則科學發現的過程及啟示

寶凡

(北京市西城區展覽路醫院,北京 100044)

一則科學發現的過程及啟示

寶凡

(北京市西城區展覽路醫院,北京 100044)

美國德克薩斯州一個腫瘤多發家族在50年間,共有10多人罹患多種惡性腫瘤,包括基底細胞癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、上頜竇癌、卵巢癌及未明確來源的癌癥。在美國國立衛生研究院的關注下,多國研究人員對其家族中一個同時患有惡性黑色素瘤、先天性耳聾、部分性DiGeorge綜合征的男性成員從年幼開始進行了10多年的追蹤研究。最終克隆出一個位于人類基因組測序GAP中的新基因-FAM230A ,提交到了美國國家生物信息數據庫,還克隆出位于患者體細胞內的雜合基因和蛋白,并發現了一些新的調節機制。研究成果最終以《t(9;22)引發p14ARF和TBX1嵌合負調控與黑色素瘤、耳聾及DNA修復缺陷相關性》為題,發表在國際知名期刊《人類突變》2013年9期上。這一研究成果,對揭秘生命科學的奧妙做出了貢獻,這一漫長的科研過程也為我們帶來了多種啟示。

基因突變 DiGeorge 綜合征 腫瘤易感家族 嵌合負調控 DNA修復

科學發現有其自身客觀規律，科學研究行為應該遵循自然規律的法則，按照一定的程序和科學邏輯，一步步靠近真理，逐步揭開自然現象的神秘面紗。作為科學發現的首要步驟，發現問題、提出假說是重要的開端，對自然界存在的反常現象熟視無睹是不能引發科學問題的，只有擁有敏銳的觀察力和持之以恒的耐力，才有可能發現待揭示的科學問題。美國國立衛生研究院的科學家們對一個腫瘤易感家族發現的特殊病例進行了多年的追蹤研究，雖然過程困難重重，但是，經過十幾年漫長的艱苦努力，在數不清的科研人員的共同參與下，最終解開了科學謎團。這一過程，不僅僅昭示了科學精神，從科研體制和治學態度等方面也具有啟示意義。

1 一個特殊綜合征病人及其多病家族

1989年，在美國德克薩斯州的奧斯汀市，出生了一個叫克里斯托弗的男性嬰兒。出生時檢查發現他的右手手指遠端關節攣縮和第五個腳趾的位置異常。隨后的幾個月里，他先后罹患過多次的耳部感染和反應性氣道疾病，在生命中的第一年，每天要吸入藥物治療和使用家庭霧化器。到13個月大時，又發現他患有感音性神經性耳聾。此后，克里斯托弗還經常發生鼻竇感染。到了1996年，克里斯托弗又因為鼻息肉做了切除術。后來，由于胸部、左手臂、腿和脖子等處長有多個痣而在德克薩斯州當地醫院做了切除手術，手術標本病理診斷為克拉克痣(Clark’s nevi)。2003年5月，克里斯托弗左肩部患上了帶狀皰疹，用泛昔洛韋治療后痊愈，未留下后遺癥。他的母親回憶說在懷孕期間做過風疹免疫。對他的家族病史調查顯示，他的父系和母系家族有顯著的癌癥家族史，他母親的一個堂妹和一個表兄分別在25歲和27歲時患過基底細胞癌和黑色素瘤。他的外公在69歲時被診斷為黑色素瘤并且在77歲時因此而死亡。母親的祖父有長期的吸煙史，在75歲時被確診患有肺癌，母親的祖母患有乳腺癌。母親的一個遠房表兄在不足50歲的年齡被診斷出患有肺癌。父系家族中，父親和祖母先證者中有四個叔叔姑姑患有基底細胞癌。在上溯50年中，家族中有超過10例的基底細胞癌患者。在近20年里，有一對雙胞胎叔叔還患有原發灶不明的癌癥，父親的一個叔叔 在55歲時患上頜竇癌，父親的一個姑姑患卵巢癌，另一個姑姑患未明確來源的癌癥[1]。

這是一個不幸卻又幸運的男孩。自從出生伊始就受到美國得克薩斯州當地醫療機構的細心照看和診斷治療，14歲時被推薦到美國國立衛生研究院(NIH， National Institutes of Health )接受診療，從此，克里斯托弗以及他的一家人受到更為嚴密的醫學觀察、觀察與治療。2003年冬季時，克里斯托弗是美國德克薩斯州奧斯汀市一所聾啞學校9年級學生，學業優秀，廣受好評。21歲時他因成績優異，獲得了到美國國會做實習生的機會。

2 重要的科學意義待揭示

2003年，鑒于其特殊復雜的病情，克里斯托弗被轉到美國國立衛生研究院皮膚科及DNA修復實驗室主任克雷默博士(Kenneth H．Kraemer)那里做進一步的診療。皮膚檢查發現他的胸部，背部和頭皮有色素丘疹，左耳后有一個色素性斑塊，病變邊界不規則。克雷默博士邀請美國軍隊醫院病理研究所的病理學家David Busch博士對病理切片進行審核，診斷為惡性黑色素瘤，并由美國空軍醫學研究所外科主任(Air Force Surgeon General)華敦德博士(Daniel Wattendorf)給予手術切除。美國國立耳聾及交流障礙研究所耳鼻喉科(Otolaryngology Branch，NIDCD)的聽力研究室主任Carmen Brewer博士和Chris Zalewski博士， 對克里斯托弗進行了聽力檢測和評估，診斷為雙側聽力缺失及前庭反應喪失。美國國立衛生研究院放射影像中心(Radiology Branch，Clinical Center)的John A． Butman博士為他做了MRI檢測，結果顯示雙側對稱性耳蝸發育不全及前庭缺失。染色體檢測結果顯示9號和22號染色體之間存在平衡易位。NIH心肺研究所V．Sachdev博士對克里斯托弗進行了心血管檢查，包括超聲心動圖、心臟磁共振成像。超聲心動圖發現克里斯托弗主動脈根部輕度擴張，主動脈瓣反流。盡管如此，克里斯托弗有沒有心臟病癥狀，他的身體狀況可以正常參與各種體育活動。五官科檢查顯示有部分典型的迪格奧爾格綜合征(DiGeorge’syndrome)特征，如頜骨狹窄、小耳廓、低耳位、人中短等。DiGeorge綜合征為非遺傳性，無家族性，由于胚胎期第三、第四咽囊發育障礙，使胸腺和甲狀旁腺缺如或發育不全而引起先天性異常，該異常的產生可能與胎兒母親子宮內某種變異相關，罹患該病的患兒常伴其他先天性畸形，本綜合征是多基因遺傳性疾病，染色體22q11區域缺失是主要原因。另外，他還有手指攣縮，第五腳趾畸形后置。家族遺傳研究顯示，克里斯托弗的父母和他的哥哥沒有攜帶染色體易位。他的父系和母系均有顯著的腫瘤家族史。

經過全面詳細的檢查，NIH給克里斯托弗的診斷是:(1)惡性黑色素瘤；(2)先天性耳聾；(3)部分性DiGeorge綜合征。

在歐美一些國家，黑色素瘤的發病率很高:黑色素瘤是澳大利亞的第一大腫瘤；在美國，每年有25000個惡性黑素瘤新增病例，年死亡約6000人，近年發病率呈急速上升趨勢。但是分子病因學卻不甚明了。先天性耳聾是常見致殘性疾病之一，新生兒中雙側先天性耳聾發生率約在1-3‰，在目前可篩查的出生缺陷中發病率最高，已成為全球關注的重大公共衛生問題。先天性耳聾的病因主要有遺傳因素和內耳正常發育異常造成。但是導致發育異常的基因迄今不明。DiGeorge綜合征由于胚胎期發育障礙，使胸腺和甲狀旁腺缺如或發育不全而引起先天性異常。

綜合以上的診斷，NIH的科學家們意識到這是一個非常罕見而珍貴的綜合病例。如果能夠在克里斯托弗的體細胞中找到9號和22號染色體之間互換的準確定位，很可能會發現與黑色素瘤、先天性耳聾以及DiGeorge綜合征相關的基因，從而在這三種疾病的預防和治療工作中起到重要作用。

3 滿懷信心起步 兩度受挫

為了定位9號和22號染色體之間的斷裂位點，2001年當克里斯托弗12歲時，克雷默博士和他的研究小組首先建立了克里斯托弗體細胞和淋巴細胞株，進一步用全染色體涂抹探針(whole chromosome painting probe，WCP)，確定了9號和22號染色體的位置互換并排除合并其它染色體之間互換或丟失的可能。并用9號和22號染色體特異性探針進行熒光原位雜交，進一步定位兩條染色體的斷裂點位于9號染色體短臂2區1帶(9p21)和22號染色體長臂1區一帶(22q11．2)。這引起了研究人員更大的興趣。因為9p21含有三個家族性黑色素瘤基因-細胞周期依賴性激酶抑制劑2A(CDKN2A)和2B(CDKN2A)[2]。而DiGeorge綜合征又稱22q11．2缺失綜合征，即DiGeorge綜合征病人的體細胞中經常缺失22q11．2區。但是，由于9p21和22q11．2區分別在9號染色體和22號染色體上橫跨19萬個堿基對和300萬個堿基對，分別含有3個基因和大約60個基因，要確定究竟是哪個基因與克里斯托弗所攜帶的綜合征有關簡直是大海撈針。由于當時的實驗技術和相關知識的局限性，沒有可行的研究手段來完成這一目標，研究工作就此擱淺。

在此期間，克里斯托弗罹患的特殊綜合征在世界范圍內引起了多位科學家的極大關注。2005年，日本藥品與醫療器械管理局(PMDA，Pharmaceuticals and Medical Devices Agency)的上田(Takahiro Ueda)博士應約來到克雷默博士的研究室，試圖根據以往文獻報道的黑色素瘤、耳聾和DiGeorge綜合征相關的基因以及人類基因組計劃所公布的這兩個區域的基因，挑選出最有可能的斷裂基因。經過兩年的努力，發現克里斯托弗的體細胞對紫外線引起的DNA損傷修復能力只有正常人的四分之一，對斷裂點分析幾乎一無所獲，研究工作陷入迷茫無助之中。

4 拓展思路 幾經挫折不氣餒 漸露端倪

2007年7月，中國訪問學者譚曉暉博士從北京大學臨床腫瘤學院分子腫瘤學實驗室來到了克雷默博士的皮膚科及DNA修復研究室。帶著對這個課題的濃厚興趣，她開始了極為艱辛的探索研究。首先，她閱讀了幾乎所有可以查閱到的關于黑色素瘤，先天性耳聾以及DiGeorge綜合征有關的文獻報道，調出美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫的相關基因。經過與克雷默博士多次交流討論，她決定通過高分辨率的基因芯片比較基因組雜交(array comparative genome hybridization，aCGH))技術來尋找斷裂點。他們與NIH的腫瘤分子遺傳學主任Paul Meltzer博士和Sarah Anzick博士合作首先提取了克里斯托弗淋巴細胞和成纖維細胞中的DNA，用熒光素標記DNA，與芯片上探針充分雜交后，用微陣列每個靶點上的兩種信號的熒光比例比較DNA在相應的序列或基因上的拷貝數變化來確定斷裂點。令人失望的是，首次實驗沒有檢測到任何有價值的變化。即便是他們用最高分辨率的芯片也不能得到任何可用的資料。他們一度認為基因芯片比較基因組雜交不能幫助檢測克里斯托弗染色體異常。研究工作再度陷入停滯階段。

帶著對科學奧秘的執著的探索欲望，譚曉暉博士繼續廣泛閱讀了大量關于比較基因組雜交技術的文獻，并重新審閱了克里斯托弗以前的核型分析。她注意到克里斯托弗的核型分析圖里是雜合性的，即每對9號和22號染色體中各只有一條發生了互換，而還各有一條是正常的。這一現象讓她突然意識到，比較基因組雜交的陰性結果會不會由于那兩條沒有互換的9號和22號染色體與互換的染色體摻雜在一起使掩蓋了丟失了的基因信號？如果能把互換的9號和22號染色體與正常的染色體分離開來，很可能就會得到比較基因組雜交的陽性結果！她興奮地與克雷默博士討論她的假設，克雷默博士非常贊同她的想法。

有了合理的假說，下一步工作就是怎樣分離異位的與正常的染色體。研究組設計用顯微切割或染色體流式分選的方式去分離細胞內的染色體。在NIH 遺傳學科(Genetics Branch)科學家Gary Stone的幫助下，成功地分離了互換的9號和22號染色體！當他們用分選的染色體再去與芯片雜交，期待的結果來到了！利用比較基因組雜交技術能把分選的發生異位的9號染色體的斷裂點定位于9p21的CDKN2A基因，斷裂點打斷了p14ARF 基因！盡管此前已有報道提示p14ARF 基因與黑色素瘤相關，但精確的機制還不明確。他們考慮到克里斯托弗體細胞DNA損傷修復能力降低是否由于異位的9號染色體打斷了p14ARF致使該基因功能損傷引起的呢？

這個發現使得他們能夠對p14ARF 基因在黑色素瘤的發生發展中的作用進行更進一步的探討奠定了基礎。于是譚曉暉博士把體外克隆的p14ARF注入克里斯托弗的體外培養的成纖維細胞里，令人驚喜的是p14ARF注入后克里斯托弗成纖維細胞的DNA 修復能力提高到了正常水平！再次敲除p14ARF后DNA 修復能力又降低原來水平。這個實驗提示由于染色體異位引起 p14ARF基因斷裂可能是造成克里斯托弗黑色素瘤的原因。基于這個理論，下一步就有可能研制p14ARF基因疫苗來預防克里斯托弗以及以后相同的病人再發生黑色素瘤！

可是，由于22號染色體的斷裂點位于22號染色體長臂1區一帶，這個區域含有各種復雜的重復序列，其中還有一個連人類基因組計劃也無法檢測的大約60個千堿基對序列荒島區(GAP)。無法制備雜交探針，比較基因組雜交技術只能幫助把22號染色體的斷裂點定位在890千堿基范圍內。經過與NIH腫瘤分子遺傳學主任梅爾澤博士(Paul Meltzer)多次探討，譚曉暉決定先用傳統的FISH 技術逐漸縮小探測范圍。在隨后的工作中，先后用了十幾個FISH 探針，才把22號斷裂點縮小在350千堿基對范圍內。但是，新遇到的各種復雜的重復序列使她無法再進行檢測工作，研究工作再次擱淺。

于是，譚曉暉博士又繼續在文獻中尋找突破點。她除了吃飯和必須的睡眠時間，把幾乎所有的時間都花費在世界上最大的醫學圖書館-美國國立醫學圖書館(National Library of medicine，NLM)，查閱了幾乎所有與22號染色體長臂1區一帶有關的書籍和文獻。功夫不負有心人！終于她發現了幾篇關于DiGeorge綜合征病和22q11．2缺失相關的文獻[3][4][5]。其中有幾篇文獻報道在克隆22號染色體長臂1區一帶與其它染色體互換的文獻，發現這些斷裂點序列幾乎相同，都存在于那個大約60個千堿基對序列荒島區(GAP)。這個發現讓她想到克里斯托弗的斷裂點會不會也在這個易位熱點上？她興奮的連夜給克雷默博士發郵件闡述自己的想法。克雷默博士非常贊同她的設想。為了證實自己的假說，她參照以往文獻序列用了幾百對引物對克里斯托弗的DNA進行PCR擴增。但是由于周圍的重復序列，難以得到PCR產物，這個辦法又失敗了！她于是又嘗試了各種PCR試劑，摸索了各種PCR擴增條件，終于在2009年，她接手該項研究的第三年，獲得了期待中的結果--在凝膠成像儀上清晰地看到從克里斯托弗DNA中擴增出來的不同于其父母和其他正常人的異常條帶！經過DNA測序證實，這個異常條帶正是研究者向往已久的含有部分9號染色體和部分22號染色體的雜合型DNA序列！也就是說克里斯托弗的22號染色體斷裂點也落在了這個22號染色體易位熱點上。研究工作取得了重大的進展！

22號染色體易位熱點只含有大約600個堿基，參照以往文獻報道中以及GENEBANK 公布的22號染色體斷裂點周圍BAC序列，也只有大約13個千堿基對可供參考。13個千堿基對以外就是所謂的荒島區(GAP)。由于該GAP含有多個染色體易位熱點，各國科學家們已經長期以來對該區進行研究克隆，但由于復雜重復序列不能對之進行擴增測序，只能望洋興嘆。當她拿著這個成功獲得的雜合性序列到克雷默博士辦公室向他報告時，克雷默博士激動的不知說什么好。他們終于克隆到了這個斷裂點。接下來，如果能從將克里斯托弗22號染色體斷裂的兩端序列加以延伸，就可以知道斷裂點究竟是落在一個什么序列上，一個基因還是一個重要的基因調節序列，它的重要意義在于可以填補人類基因組計劃的GAP空缺！

帶著這個幻想，譚曉暉博士又投入了緊張而興奮的實驗研究中。為了延伸22號染色體斷裂的兩端序列，她先后與多名在各自研究領域內知名的NIH科學家合作，嘗試了多種DNA水平的PCR方法，這些專家包括Developmental Therapeutics Branch研究室主任，Genome Structure and Function Group主任，獲得克隆重復序列專利的Vladimir L． Larionov教授等，通過TAR cloning(The transformation-associated recombination)來鑒定22號染色體斷裂的兩端序列。但是，同樣由于該序列的復雜性，這些嘗試均告失敗。

面對新的失敗，經過慎密的思考，失敗的原因在哪里？之所以不能進行PCR擴增的是因為復雜的重復序列。那么如何繞開這些重復序列行不行呢？為什么不可以在RNA或蛋白水平探索一下？譚曉暉博士再次為自己的這一新的想法感到興奮。當她把自己的想法對克雷默博士講后，克雷默博士建議共同咨詢NIH生物信息學專家Medha Bhagwat博士，Medha Bhagwat博士是美國國家生物信息學中心的資深顧問，曾參與構建了NCBI GenBank數據庫。經過咨詢，根據Medha Bhagwat博士的建議，經過多種生物信息工具分析，他們發現斷裂點周圍的序列與GAP以外的一個預測基因LOC653203有很高的同源性，也就是說，斷裂點周圍的序列完全有可能編碼基因。

帶著疑惑，克雷默博士和本實驗室的副主任迪喬瓦尼(John J．DiGiovanna)博士決定共同再次訪問腫瘤分子遺傳學主任梅爾澤博士。當譚曉暉博士將自己的實驗計劃講述給梅爾澤博士后，梅爾澤博士否定了這個做法。他說，這個區域根本就是非編碼區這么多的大小重復序列說明根本不可能編碼基因，也就是說，根本不能在RNA更不用說在蛋白水平進行擴展。再說，對這個區域的研究已經有相當漫長的歷史了，并且都是世界頂尖級的實驗室。如果這么容易，那些人早就報道了。克雷默博士和迪喬瓦尼博士聽到這個基因組專家的論證，也表示這個方案不切實際，建議終止課題研究，將已經取得的研究結論公開發表。

5 堅韌不拔 終獲成功

從梅爾澤博士那里回來以后，雖然這位業界大腕兒專家給出了明確的否定結論，譚曉暉博士內心還是有些不甘心，她仔細比對了已經獲得的斷裂點周圍的序列，發現有些序列還是有編碼基因的可能。鑒于該區含有多種重復序列的特性，很可能被染色體易位打斷的部位是一個與預測基因LOC653203有很高同源性的新基因。于是她決定自己先悄悄的進行實驗，等到拿出明確的結果，再公開自己的看法，她對自己的判斷很有信心！于是，她首先按照預測基因LOC653203的外顯子序列設計了多對PCR引物對克里斯托弗的RNA-步移PCR擴增，開始的時候還是一無所獲，隨著實驗的深入，有時可以得到一些雜帶。又經過對實驗條件的反復摸索、調整和枯燥的重復，終于可以從克里斯托弗的RNA中擴增到一些與其父母以及其他正常人RNA不同的產物。她又將這些不同的擴增產物經純化后測序，最后終于得到了她想要的雜合序列- 一半來自p14ARF基因一半來自22號染色體斷裂點周圍的序列！這意味著，克里斯托弗易位斷裂點周圍序列確實是一個可編碼基因!經過了漫長的期待和辛勤的勞動，自己的假想終于得到了證實！

當她第二天把克雷默博士帶到自己實驗室電腦前給他看這個研究結果時，克雷默博士盯著測序圖足足幾分鐘沒講話，然后他激動地突然呼叫研究室副主任:“迪喬瓦尼，快來!” 迪喬瓦尼趕來以后仔細盯著測序圖看明白后，大聲驚呼一聲:“上帝啊”。三人相視歡呼，喜極而泣！隨后，克雷默博士回到他的辦公室立即給梅爾澤博士打電話說，譚曉暉博士got a wonderful result!

可以想象，對于譚曉暉博士和整個研究組來說，經過了千辛萬苦，終于獲得預期結果的那一天，該是度過了怎樣一個激動的難眠之夜啊！

在此基礎上，又經過多種實驗終于克隆出一個位于人類基因組測序GAP中的新基因-FAM230A Gene 。他們把這個新基因提交到了美國國家生物信息數據庫。接著，譚曉暉博士又克隆出位于克里斯托弗體細胞內的雜合基因和蛋白。并發現了一些新的調節機制。

經過六年不分晝夜的艱苦努力，譚曉暉博士在NIH這個研究平臺上，在前人的研究基礎上，在數不清的多位頂尖科學家的共同協助下，終于揭開了這個謎團。他們的研究成果最終以《t(9；22)引發p14ARF和TBX1嵌合負調控與黑色素瘤、耳聾及DNA修復缺陷相關性》[1](Chimeric Negative Regulation ofp14ARF and TBX1by a t(9；22)Translocation Associated with Melanoma， Deafness，and DNA Repair Deficiency)為題，發表在國際知名期刊《人類突變》2013年9期(human mutation)上。這一研究成果，對揭秘生命科學的奧妙做出了貢獻。

6 結語

針對一個不常見的病人，科學研究人員應該采取什么樣的治學態度呢？從這一課題的研究實踐中，體現出了敏銳的探索思維，進而轉化為對未知事物的研究行動。廣袤無垠的神秘的自然界，不正是在人類的一點一滴的探索中，逐漸揭開了它的面紗嗎？！

科學研究工作有它自己的客觀規律，科學發現行為本身，是偶然性和必然性的合理結合。鍥而不舍的求索過程是最終獲得成功的必然先決條件，但是成功的來臨經常是偶然促成的，在必然進程中，偶然就會不經意的到來。所以對科學研究行為人為地設定期限，要求在設定的日期內獲得結果，這個設定本身就是不科學的。本課題前后用了10多年的時間，數不清的研究人員先后為之努力奮戰，因為它的科學意義，課題組無條件地獲得了支持，最終取得了成功。試想如果最初的時候要求課題組3年或者5年結題，那只能有一個結果，就是半途而廢。

資金支持是研究工作的基礎，10多年來，政府對該課題的資金投入達到百萬美元以上。對認定的有意義的工作不計投入，有耐心，有信心，營造寬松的學術研究的大環境，讓科研人員能夠全身心地投入工作，是獲得成功的重要的條件。

[1] Xiaohui Tan,Sarah L.Anzick,Kenneth H.Kraemer,etc.Chimeric Negative Regulation ofp14ARFandTBX1by at(9;22)Translocation Associated with Melanoma,Deafness,and DNA Repair Deficiency.HUMAN MUTATION,Vol.34,No.9,1250-1259,2013.

[2] Holmes SE,Emanuel BS,BudarfML,etc.1997.Disruption of the clathrin heavy chain-like gene(CLTCL)associatedwith features of DGS/VCFS:a balanced(21;22)(p12;q11)translocation.Hum MolGenet 6:357-367.

[3] Kehrer-Sawatzki H,Haussler J,Assum G,etc.1997.The second case of a t(17;22)in a family with neurofibromatosis type 1:sequence analysis of the breakpoint regions.Hum Genet 99:237-247.

[4] Liao J,Kochilas L,Adams J,Morrow BE,etc.2004.Full spectrum of malformations in velo-cardio-facialsyndrome/DiGeorge syndrome mouse models by altering Tbx1 dosage.Hum Mol Genet 13:1577-1585.

[5] Shaikh TH,Kurahashi H,Emanuel BS,etc.2000.Chromosome 22-specific low copy repeats and the 22q11.2 deletion syndrome:genomic organization and deletion endpoint analysis.Hum Mol Genet 9:489-501.