兩種重組抗CD20人源化單克隆抗體定量分析方法的比較及其在藥代動力學研究中的應用

鄧承蓮+鄒佳+歐倫+董立厚+宋海峰

摘 要 采用酶聯免疫吸附分析（ELISA）與基于Wil2 S細胞的流式細胞術（FCA）兩種方法對生物基質中的重組抗CD20人源化單克隆抗體（rh anti CD20zumab）進行定量分析，并對兩種方法進行系統比較。方法學驗證結果表明，兩種方法均具有良好的特異性、精密度和準確度，但定量范圍存在明顯差異。ELISA法批內和批間精密度均小于19.5%，準確度為二者定量范圍分別為0.04～5.0 mg/L和3.1～200 mg/L，ELISA法的靈敏度顯著高于FCA法。利用兩種方法測定獼猴靜脈滴注rh anti CD20zumab后的血藥濃度 時間變化并進行藥代動力學（PK）分析。結果表明，在給定劑量下，通過兩種方法獲得的PK結果具有良好的一致性。FCA法是一種細胞表面抗原靶向性抗體類藥物PK研究及藥效動力學（PD）研究的快捷、理想的方法。

關鍵詞 抗CD20單克隆抗體；人源化；ELISA；流式細胞術；藥代動力學

1 引 言

近年來，隨著抗體藥物應用的迅猛發展，該類藥物的藥代動力學（Pharmacokinetics，PK）與毒代動力學（Toxicokinetics，TK）研究成為一大熱點。目前，在抗體的PK研究中，定量分析方法主要依賴基于免疫微孔板的配體結合分析（Ligand binding assays，LBA）方法，如酶聯免疫吸附分析（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）等[1，2]。此外，基于免疫相關技術的表面等離子諧振（Surface plasmon resonance，SPR）[3]，Gyros[4，5]，電化學發光（Electrochemiluminescence，ECL）[1，6]等定量分析方法也在快速發展。在免疫分析方法中，通常需要精制的抗原以及特異性的單克隆抗體用于生物基質中被分析物的捕獲與檢測。但面對各種層出不窮的新型抗體藥物，商品化的特異性單抗極少。因此，制備靶抗原、特異性抗體或抗獨特型（Idiotype，ID）抗體，往往成為生物分析方法建立乃至整個PK/TK研究的瓶頸。在此情況下，不依賴于精制抗原或特異性抗體的分析方法如流式細胞術（Flow cytometry assay，FCA）[7]、液相色譜 質譜聯用[8]等方法有望大大加快抗體藥物的研發進程。但這些方法的適用性及通用性尚有待于進一步考證。本研究建立了基于FCA的抗體藥物定量分析方法，并對其方法學以及在PK研究中的應用進行了考察。同時，對FCA法與經典的ELISA法進行了系統的比較。試圖對FCA法定量分析抗體藥物的方法提供較全面的評估，為后續該類藥物的研究提供實驗依據。

本研究選用重組抗CD20人源化單克隆抗體（rh anti CD20zumab）作為目標藥物。它是基于人 鼠嵌合型單克隆抗體利妥昔單抗（Rituximab）的結構進行人源化改造而成，其CDR區與利妥昔單抗一致。針對該抗體，以抗利妥昔單抗的抗ID抗體作為捕獲抗體（此抗ID抗體靶點為rh anti CD20zumab的CDR段），建立了靈敏高效的夾心ELISA法；同時，建立了基于B淋巴細胞表面抗原競爭的FCA法。在對兩種方法分別進行了全面驗證之后，利用兩種方法同時對獼猴靜脈滴注rh anti CD20zumab（30 mg/kg）后的藥代動力學生物樣品進行了分析。試圖研究和對比不同分析方法測得的藥物PK行為的異同，為抗體藥物PK的深入研究奠定基礎。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Guava微毛細管分析儀（Easycyte HT，美國Millipore公司）；超純水系統（美國Millipore公司）；ZW A微量振蕩器（國華電器有限公司）；超凈工作臺（東聯哈爾儀器制造有限公司）；微量加樣器（德國Brand公司）；4MK2洗板機（美國Thermo公司）；MK3酶標儀（美國Thermo公司）。

rh anti CD20zumab（批號：20121101，純度>98%）和FITC標記的rh anti CD20zumab由上海醫藥集團有限公司提供；猴血清吸附HRP標記的山羊抗人IgG多克隆抗體（Bethyl公司，批號：A80 319P 15）；抗利妥昔單抗抗體（AbD Serotec公司，批號：110213）；人IgG（Rockland公司，批號：009 0102）；小鼠IgG（Abcam公司，批號：ab37355）；Wil2 S細胞由本實驗室保存。

2.2 藥代動力學實驗

健康獼猴4只，雌雄各半，體重（4.0±0.2） kg；于后肢外側靜脈滴注rh anti CD20zumab，0.5 h滴注完畢。于滴注前和滴注后10，20，30 min（滴注結束）；1，2，3，4，5，6，8，10，12，24，36 h；2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，14，16，18，20，22 d在非給藥側后肢或前肢靜脈取血約2 mL，分離血清，于

Symbolm@@ 80 ℃保存待測。

2.3 實驗方法

2.3.1 雙抗體夾心ELISA法的標準曲線及質控樣品制備 用空白獼猴血清將rh anti CD20zumab標準品倍比稀釋至19.5～10000 μg/L；另用同樣方法單獨配制濃度為3750，500和100 μg/L的質控樣品；分析方法確證中，增加2個驗證樣品，濃度分別為5000 μg/L（ULOQ）和39.1 μg/L（LLOQ）。配制的標準標曲及質控樣品分裝后于

2.3.2 FCA的標準曲線及質控樣品制備 用空白獼猴血清將rh anti CD20zumab標準品倍比稀釋至2.0～400 mg/L；另用同樣方法單獨配制濃度為150，40.0和6.0 mg/L的質控樣品；分析方法確證中，增加2個驗證樣品，濃度分別為200 mg/L（ULOQ）和3.1 mg/L（LLOQ）。配制的標準曲線及質控樣品分裝后于

2.3.3 雙抗體夾心ELISA法測定血清中rh anti CD20zumab濃度 抗利妥昔單抗抗體每孔100 μL包被酶標板，4 ℃靜置過夜。取包被板封閉后，加入經稀釋液前處理（1∶100）后的標準溶液、各類質控樣品溶液及待測樣品，每個樣品設2個復孔，室溫孵育2 h。洗板3次后，加入猴血清吸附HRP標記的山羊抗人IgG多克隆抗體稀釋液100 μL/孔，室溫孵育1 h，洗滌液洗板6次后，每孔加入100 μL底物TMB（TMB濃縮液 TMB顯色液，1∶20，V/V），室溫避光反應13 min，加入1 mol/L H2SO4終止反應，50 μL/孔，立即用酶標儀在450 nm處測定吸光度，參比波長630 nm。

2.3.4 FCA測定血清中rh anti CD20zumab濃度 采用獼猴空白血清將待測樣品中rh anti CD20zumab按一定稀釋倍數稀釋至標準曲線范圍內，在未經稀釋液前處理的標準溶液、各類質控樣品溶液及待測樣品中加入等體積100 mg/L FITC標記的rh anti CD20zumab。取對數生長期的Wil2 S細胞，1000 r/min離心8 min，用PBS洗滌一次，計數，再用PBS將細胞密度調整至1.6×106 個/mL，將細胞懸液分至EP管中。將以上方法制備的標準溶液、各類質控樣品溶液及待測樣品加入分好細胞懸液的一次性管中；室溫振蕩孵育45 min后重懸于200 μL PBS中。GUAVA測定熒光強度。

2.4 結果計算

使用MicroCal公司Origin 7.5軟件對濃度對數和各管樣品響應值Y繪制標準曲線，四參數Logistic擬合（其中最高濃度點與最低濃度點為錨定點，不參與擬合計算）：

其中，Emax和Emin分別為S 形曲線的最大值和最小值；EC50為50%響應值對應的濃度； Slope為斜率，即響應值隨rh anti CD20zumab濃度的變化率。用同一批次設置的標準曲線，計算樣品中rh anti CD20zumab濃度。

同時采用WinNonlin軟件計算獼猴血清中rh anti CD20zumab的PK參數。

3 結果與討論

3.1 方法學驗證

3.1.1 特異性 按照制備標準曲線的方法制成低濃度質控樣品（ELISA為0.10 mg/L， FCA為6.0 mg/L），并使其中含有高濃度（ELISA為5.0 μg/L， FCA為2000 μg/L）的小鼠IgG和人IgG，使用雙抗體夾心ELISA和FCA進行交叉反應實驗。由表1可見，兩種抗體的回收率及測量精密度（RSD）均在

藥代動力學研究可接受范圍內，顯示rh anti CD20zumab與小鼠IgG和人IgG抗體未發生交叉反應，這表明在獼猴血清中存在50和2000 mg/L 的小鼠IgG或人IgG時，均不會影響待測抗體的準確性，但FCA優于ELISA。

3.1.2 定量范圍和靈敏度 獼猴血清制備標準曲線，批間重復5次。由圖1可見，兩種方法的標準曲線都具有良好的線性和重現性。ELISA法測得的OD值直接反映rh anti CD20zumab的濃度，其定量范圍為0.04～5.0 mg/L；FCA測得的熒光強度間接反映rh anti CD20zumab的濃度，其定量范圍為3.1～200 mg/L。由此可知，FCA的靈敏度與ELISA相比， 靈敏度相差約兩個數量級，但以往研究表明，治療性抗體類藥物的給藥劑量往往可達到mg/kg級[9～11]，因此FCA的靈敏度已足以滿足絕大多數該類藥物PK研究的要求。

圖1 ELISA法（A）和FCA法（B）測定的標準曲線（n=5）

Fig.1 Calibration curve using ELISA（A）and flow cytometry assay （FCA）（B）（n=5）

3.1.3 方法的精密度和準確度 選取兩種方法的定量上限（ELISA為5.0 mg/L，FCA為200 mg/L）和定量下限（ELISA為39 μg/L，FCA為3.1 mg/L）以及標準曲線的高、中、低（ELISA為3750，500和100 μg/L，FCA為150，40和6.0 mg/L）3個質控濃度評價2種方法的批內和批間精密度以及準確度。其中，精密度和準確度分別用RSD和RE值評價。從表2可見，ELISA的批內和批間RSD值分別小于19.5%和12.7%，FCA的批內和批間RSD值分別小于19.0%和15.4%； ELISA的RE在

之間。兩種方法精密度和準確度非常接近，且均滿足生物技術藥物PK研究要求。

3.1.4 稀釋線性 rh anti CD20zumab以30 mg/kg靜脈滴注于獼猴體內，給藥后一定時間內血清中的實際藥物濃度高于標準曲線的最高濃度，測定時需要進行稀釋后才能落入定量范圍內。因此需要考察稀釋方法。如表3所示，將已知濃度（ ELISA為60.0， 30.0， 6.00和1.00 mg/L， FCA為800， 500， 500和300 mg/L）的rh anti CD20zumab標準品進行不同倍數（ELISA為500， 50， 5和2倍， FCA為50， 20， 5和2倍）稀釋后，其準確度均小于15%，滿足生物分析方法學要求。因此，對血漿樣品進行一定倍數（ELISA 為2～500倍，FCA 為2～50倍）稀釋后測定，兩種方法得到的結果仍準確可信。

3.2 ELISA和FCA測定獼猴給藥后血清中rh anti CD20zumab的濃度

獼猴經靜脈滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，于不同時間點取血，采用ELISA和FCA分別測定血藥濃度。結果表明，給藥后血藥物濃度迅速上升，給藥30 min后（滴注完畢）血藥濃度達到最大值，其后逐漸下降，兩種方法都能檢測到給藥后22 d（大于4個半衰期）血液中的藥物。同時，兩種不同方法測定結果顯示出良好的一致性，如圖2所示。

3.3 ELISA和FCA測定獼猴給藥后血清中rh anti CD20zumab的PK參數

獼猴靜脈滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，用ELISA和FCA測定經計算得到的主要PK參數如表4所示，兩種方法測定得到的獼猴體內PK參數高度吻合；統計學t檢驗結果表明，兩種不同方法測得的rh anti CD20zumab參數沒有統計學差異（p>0.05）。

4 結 論

以往研究中，在缺乏高親和力特異性抗體時，ELISA法進行定量分析常用多抗作為替代，但在純生物基質中，此類方法極易出現交叉反應， 從而影響其特異性[12]；而FCA法在血清基質中受到的干擾更少，且樣品不需進行前處理，因此在樣品制備時更為方便，并且在數小時內即可完成一個分析批的樣品分析，大大縮短了分析周期。因此，FCA法是一種較為快捷、簡便、穩定且特異性高的檢測方法。對于大多數治療性抗體而言，在短期內難以獲得理想捕獲抗體，可以用FCA法代替ELISA法進行分析。但值得注意的是，采用FCA法進行PK研究時，盡量保證細胞活率>90%，同時每次使用的細胞密度應保持一致，減少批間誤差。

本研究結果表明，FCA法的LLOQ明顯高于ELISA法，即靈敏度相對較低。對給藥劑量相對較高（mg/kg水平）的治療性單克隆抗體類藥物，FCA法雖然具有明顯的優點和特點，但在面對給藥劑量相對較低的藥物（如細胞因子類藥物，給藥劑量通常在μg/kg水平）時，FCA較高的LLOQ可能會影響PK整體輪廓，尤其是濃度極低的末端消除相的描述。

同時，本研究中部分動物在末端消除期觀察到一個快速“椅狀”清除相（未顯示），這提示在動物體內可能存在抗原介導的抗體清除機制。如能結合藥物的藥效、抗藥抗體產生和組織分布的結果，將進一步闡述其PK/PD的相關性，并得到該抗體在體內吸收、分布、代謝和排泄的完整流程。這將為類似治療性抗體在體內PK行為的深入研究奠定基礎。

References

1 Damen C W， Schellens J H， Beijnen J H.Hum. Antibodies，2009， 18（3）： 47-73

2 Swann P G， Shapiro M A.Bioanalysis， 2011， 3（6）： 597-603

3 Che J， Wang H， Chen Z， Li X， Hou Y， Shan C， Cheng Y.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2009， 50（2）： 183-188

4 Given A M， Whalen P M， O′Brien P J， Ray C A.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2012， 64-65： 8-15

5 Mikulskis A， Yeung D， Subramanyam M， Amaravadi L.J. Immunol. Methods， 2011， 365 （1-2）： 38-49

6 Thway T， Macaraeg C， Calamba D， Patel V， Tsoi J， Ma M， Lee J， DeSilva B.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2010， 51（3）： 626-632

7 Yver A， Homery M C， Fuseau E， Guemas E， Dhainaut F， Quagliaroli D， Beliard R， Prost J F.Vox Sang.， 2012， 103（3）： 213-222

8 van den Broek I， Niessen W M， van Dongen W D.J. Chromatogr. B， 2013， 929： 161-179

9 Brok H P， Tekoppele J M， Hakimi J， Kerwin A， Nijenhuis E M， De Groot C W， Bontrop R E， Hart B A.Clin. Exp.Immunol.， 2001， 124（1）： 134-141

10 Vaidyanathan A， McKeever K， Anand B， Eppler S， Weinbauer G F， Beyer J C.Toxicol. Sci.， 2011， 119（1）： 116-125

11 Amano J， Masuyama N， Hirota Y， Tanaka Y， Igawa Y， Shiokawa R， Okutani T， Miyayama T， Nanami M， Ishigai M.Drug Metab. Dispos.， 2010， 38（12）： 2339 2346

12 LIU Ruo Rui， CHEN Zhi Hang， XU Xian Xing， SUN Li Li， LIU Yun Long， CHENG Yuan Guo.Letters in Biotechnology， 2011， 22（2）： 220-224

劉若瑞， 陳知航， 許先興， 孫麗麗， 劉運龍，程遠國. 生物技術通訊， 2011， 22（2）： 220-224

3.3 ELISA和FCA測定獼猴給藥后血清中rh anti CD20zumab的PK參數

獼猴靜脈滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，用ELISA和FCA測定經計算得到的主要PK參數如表4所示，兩種方法測定得到的獼猴體內PK參數高度吻合；統計學t檢驗結果表明，兩種不同方法測得的rh anti CD20zumab參數沒有統計學差異（p>0.05）。

4 結 論

以往研究中，在缺乏高親和力特異性抗體時，ELISA法進行定量分析常用多抗作為替代，但在純生物基質中，此類方法極易出現交叉反應， 從而影響其特異性[12]；而FCA法在血清基質中受到的干擾更少，且樣品不需進行前處理，因此在樣品制備時更為方便，并且在數小時內即可完成一個分析批的樣品分析，大大縮短了分析周期。因此，FCA法是一種較為快捷、簡便、穩定且特異性高的檢測方法。對于大多數治療性抗體而言，在短期內難以獲得理想捕獲抗體，可以用FCA法代替ELISA法進行分析。但值得注意的是，采用FCA法進行PK研究時，盡量保證細胞活率>90%，同時每次使用的細胞密度應保持一致，減少批間誤差。

本研究結果表明，FCA法的LLOQ明顯高于ELISA法，即靈敏度相對較低。對給藥劑量相對較高（mg/kg水平）的治療性單克隆抗體類藥物，FCA法雖然具有明顯的優點和特點，但在面對給藥劑量相對較低的藥物（如細胞因子類藥物，給藥劑量通常在μg/kg水平）時，FCA較高的LLOQ可能會影響PK整體輪廓，尤其是濃度極低的末端消除相的描述。

同時，本研究中部分動物在末端消除期觀察到一個快速“椅狀”清除相（未顯示），這提示在動物體內可能存在抗原介導的抗體清除機制。如能結合藥物的藥效、抗藥抗體產生和組織分布的結果，將進一步闡述其PK/PD的相關性，并得到該抗體在體內吸收、分布、代謝和排泄的完整流程。這將為類似治療性抗體在體內PK行為的深入研究奠定基礎。

References

1 Damen C W， Schellens J H， Beijnen J H.Hum. Antibodies，2009， 18（3）： 47-73

2 Swann P G， Shapiro M A.Bioanalysis， 2011， 3（6）： 597-603

3 Che J， Wang H， Chen Z， Li X， Hou Y， Shan C， Cheng Y.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2009， 50（2）： 183-188

4 Given A M， Whalen P M， O′Brien P J， Ray C A.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2012， 64-65： 8-15

5 Mikulskis A， Yeung D， Subramanyam M， Amaravadi L.J. Immunol. Methods， 2011， 365 （1-2）： 38-49

6 Thway T， Macaraeg C， Calamba D， Patel V， Tsoi J， Ma M， Lee J， DeSilva B.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2010， 51（3）： 626-632

7 Yver A， Homery M C， Fuseau E， Guemas E， Dhainaut F， Quagliaroli D， Beliard R， Prost J F.Vox Sang.， 2012， 103（3）： 213-222

8 van den Broek I， Niessen W M， van Dongen W D.J. Chromatogr. B， 2013， 929： 161-179

9 Brok H P， Tekoppele J M， Hakimi J， Kerwin A， Nijenhuis E M， De Groot C W， Bontrop R E， Hart B A.Clin. Exp.Immunol.， 2001， 124（1）： 134-141

10 Vaidyanathan A， McKeever K， Anand B， Eppler S， Weinbauer G F， Beyer J C.Toxicol. Sci.， 2011， 119（1）： 116-125

11 Amano J， Masuyama N， Hirota Y， Tanaka Y， Igawa Y， Shiokawa R， Okutani T， Miyayama T， Nanami M， Ishigai M.Drug Metab. Dispos.， 2010， 38（12）： 2339 2346

12 LIU Ruo Rui， CHEN Zhi Hang， XU Xian Xing， SUN Li Li， LIU Yun Long， CHENG Yuan Guo.Letters in Biotechnology， 2011， 22（2）： 220-224

劉若瑞， 陳知航， 許先興， 孫麗麗， 劉運龍，程遠國. 生物技術通訊， 2011， 22（2）： 220-224

3.3 ELISA和FCA測定獼猴給藥后血清中rh anti CD20zumab的PK參數

獼猴靜脈滴注30 mg/kg rh anti CD20zumab后，用ELISA和FCA測定經計算得到的主要PK參數如表4所示，兩種方法測定得到的獼猴體內PK參數高度吻合；統計學t檢驗結果表明，兩種不同方法測得的rh anti CD20zumab參數沒有統計學差異（p>0.05）。

4 結 論

以往研究中，在缺乏高親和力特異性抗體時，ELISA法進行定量分析常用多抗作為替代，但在純生物基質中，此類方法極易出現交叉反應， 從而影響其特異性[12]；而FCA法在血清基質中受到的干擾更少，且樣品不需進行前處理，因此在樣品制備時更為方便，并且在數小時內即可完成一個分析批的樣品分析，大大縮短了分析周期。因此，FCA法是一種較為快捷、簡便、穩定且特異性高的檢測方法。對于大多數治療性抗體而言，在短期內難以獲得理想捕獲抗體，可以用FCA法代替ELISA法進行分析。但值得注意的是，采用FCA法進行PK研究時，盡量保證細胞活率>90%，同時每次使用的細胞密度應保持一致，減少批間誤差。

本研究結果表明，FCA法的LLOQ明顯高于ELISA法，即靈敏度相對較低。對給藥劑量相對較高（mg/kg水平）的治療性單克隆抗體類藥物，FCA法雖然具有明顯的優點和特點，但在面對給藥劑量相對較低的藥物（如細胞因子類藥物，給藥劑量通常在μg/kg水平）時，FCA較高的LLOQ可能會影響PK整體輪廓，尤其是濃度極低的末端消除相的描述。

同時，本研究中部分動物在末端消除期觀察到一個快速“椅狀”清除相（未顯示），這提示在動物體內可能存在抗原介導的抗體清除機制。如能結合藥物的藥效、抗藥抗體產生和組織分布的結果，將進一步闡述其PK/PD的相關性，并得到該抗體在體內吸收、分布、代謝和排泄的完整流程。這將為類似治療性抗體在體內PK行為的深入研究奠定基礎。

References

1 Damen C W， Schellens J H， Beijnen J H.Hum. Antibodies，2009， 18（3）： 47-73

2 Swann P G， Shapiro M A.Bioanalysis， 2011， 3（6）： 597-603

3 Che J， Wang H， Chen Z， Li X， Hou Y， Shan C， Cheng Y.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2009， 50（2）： 183-188

4 Given A M， Whalen P M， O′Brien P J， Ray C A.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2012， 64-65： 8-15

5 Mikulskis A， Yeung D， Subramanyam M， Amaravadi L.J. Immunol. Methods， 2011， 365 （1-2）： 38-49

6 Thway T， Macaraeg C， Calamba D， Patel V， Tsoi J， Ma M， Lee J， DeSilva B.J. Pharm. Biomed. Anal.， 2010， 51（3）： 626-632

7 Yver A， Homery M C， Fuseau E， Guemas E， Dhainaut F， Quagliaroli D， Beliard R， Prost J F.Vox Sang.， 2012， 103（3）： 213-222

8 van den Broek I， Niessen W M， van Dongen W D.J. Chromatogr. B， 2013， 929： 161-179

9 Brok H P， Tekoppele J M， Hakimi J， Kerwin A， Nijenhuis E M， De Groot C W， Bontrop R E， Hart B A.Clin. Exp.Immunol.， 2001， 124（1）： 134-141

10 Vaidyanathan A， McKeever K， Anand B， Eppler S， Weinbauer G F， Beyer J C.Toxicol. Sci.， 2011， 119（1）： 116-125

11 Amano J， Masuyama N， Hirota Y， Tanaka Y， Igawa Y， Shiokawa R， Okutani T， Miyayama T， Nanami M， Ishigai M.Drug Metab. Dispos.， 2010， 38（12）： 2339 2346

12 LIU Ruo Rui， CHEN Zhi Hang， XU Xian Xing， SUN Li Li， LIU Yun Long， CHENG Yuan Guo.Letters in Biotechnology， 2011， 22（2）： 220-224

劉若瑞， 陳知航， 許先興， 孫麗麗， 劉運龍，程遠國. 生物技術通訊， 2011， 22（2）： 220-224