頂空氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法分析糞便中揮發(fā)性脂肪酸

江振作+王躍飛+陳榮榮+朱彥+張蕾+劉雙+劉海利??

摘 要 建立了一種快速分析糞便中揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acids， VFAs）的頂空氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法（Headspace gas chromatography mass spectrometry， HS GC/MS）。糞便樣品用6% H3PO4溶液按1∶2（m/V）混懸后密封于頂空進(jìn)樣瓶中，直接進(jìn)行HS GC/MS檢測。頂空振蕩室加熱溫度為80 ℃，振蕩加熱時間30 min，頂空進(jìn)樣針溫度為80 ℃，不分流進(jìn)樣1 mL；采用DB FFAP毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為250 ℃，升溫程序（初始溫度50℃保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃），載氣（高純氦）流速為1.0 mL/min； 使用電子轟擊（Electron impact， EI）離子源，電子能量為

Symbolm@@ 70 eV，離子源溫度為250 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，電子倍增器電壓為0.95 kV，全掃描模式，掃描范圍m/z33～200。結(jié)果表明， 本方法能夠應(yīng)用于人及大鼠糞便中揮發(fā)性脂肪酸的分析，通過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，采用對照品比對以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析的方法，在人的糞便樣品中檢測到9種揮發(fā)性脂肪酸：乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸、己酸、庚酸；在大鼠糞便中檢測到8種揮發(fā)性脂肪酸：乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸。通過峰面積歸一化法，計(jì)算得到乙酸、丙酸、丁酸的相對百分含量約占揮發(fā)性脂肪酸總量的85%。本方法簡單、靈敏，可用于人和大鼠糞便中揮發(fā)性脂肪酸的快速檢測。

關(guān)鍵詞 頂空氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法； 糞便； 腸道菌群； 揮發(fā)性脂肪酸

1 引 言

腸道菌群（Gut microbiota）是維系人體腸道微生態(tài)平衡的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)和活性受宿主的基因、營養(yǎng)狀況和生活方式等因素的影響[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，正常的腸道菌群在人體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，不僅參與人體能量和物質(zhì)代謝，而且還可以抵御外來致病菌的定植，刺激人體免疫系統(tǒng)的發(fā)育[2，3]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)腸道菌群發(fā)生紊亂時，會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如肥胖[4]、糖尿病[5]、過敏性疾病[6]、癌癥[7]、艾滋病[8]等。因此，監(jiān)測人體內(nèi)腸道菌群的變化，對維持人類健康具有重要意義。

糞便中的揮發(fā)性脂肪酸主要由短鏈脂肪酸（Short chain fatty acid， SCFA）構(gòu)成，短鏈脂肪酸是指碳鏈為1～6的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸[9]，是由腸道菌群代謝腸道內(nèi)未消化的碳水化合物產(chǎn)生的，是腸道菌群的重要代謝產(chǎn)物，其含量變化能夠反映機(jī)體內(nèi)腸道菌群的狀況。其中，乙酸、丙酸、丁酸約占揮發(fā)性脂肪酸總量的85%～90%，是結(jié)腸中主要的陰離子，可以刺激水、鈉的吸收，維持人體腸道內(nèi)電解質(zhì)平衡。短鏈脂肪酸能降低結(jié)腸內(nèi)pH值，抑制致病菌的繁殖；維持益生菌代謝，保持腸道菌群穩(wěn)態(tài)；營養(yǎng)結(jié)腸上皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞生長、代謝；抑制促炎因子產(chǎn)生，減少炎癥反應(yīng)，降低腸道病變；此外，短鏈脂肪酸還能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移[10]，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡及控制原癌基因表達(dá)[11]。因此，通過檢測糞便揮發(fā)性成分，不僅能夠反映機(jī)體內(nèi)短鏈脂肪酸的含量，還能反映機(jī)體內(nèi)腸道菌群的狀態(tài)，進(jìn)而評價機(jī)體的健康狀態(tài)，目前有關(guān)此類研究的報(bào)道較少。

目前，揮發(fā)性脂肪酸的檢測方法主要包括氣相色譜法（Gas chromatography， GC）[12～16]、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography， HPLC）[17～19]、毛細(xì)管電泳法（Capillaryelectrophoresis， CE）[20]和原子吸收分光光度法（Atomic absorption spectrophotography， AAS）[21]。由于揮發(fā)性脂肪酸極性大、揮發(fā)性強(qiáng)、無紫外吸收和熒光基團(tuán)，故多采用GC法分析。目前，揮發(fā)性脂肪酸多需進(jìn)行衍生化處理[12～14]，或經(jīng)過液 液萃取法[15，16]處理后再進(jìn)行GC分析，存在操作繁瑣、萃取效率低、操作時間長、提取歧視效應(yīng)、重復(fù)性較差、試劑毒性較大等不足。因此，需要建立一種簡單、快速檢測糞便中揮發(fā)性脂肪酸的方法。本研究建立了一種快速分析糞便中揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acids， VFAs）的頂空氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法（Headspace gas chromatography mass spectrometry， HS GC/MS）。糞便樣品用6%H3PO4溶液混懸后即可分析，無需進(jìn)行復(fù)雜的前處理。而Gao等[12]對糞便水溶液進(jìn)行氯甲酸乙酯化處理后進(jìn)行GC MS分析，采用兩步衍生化向糞便水溶液中依次加入L 2氯苯丙氨酸、乙醇 吡啶（6∶1，V/V）、氯甲酸乙酯，超聲1 min后加入正己烷萃取并離心，用NaOH溶液調(diào)節(jié)上清液至

pH 9～10，再加入氯甲酸乙酯混合超聲，加入含3 （甲硫基）丙酸乙酯的正己烷終止反應(yīng)，再進(jìn)行分析；又如賈益群等[15]在酸性條件下用乙醚萃取糞便水溶液中，首先用純水溶解糞便，離心過膜后，取適量糞便水溶液加入H2SO4溶液后再加入乙醚，振蕩30次后離心5 min，置4 ℃冰箱30 min，取上層乙醚溶液進(jìn)行GC分析。本方法與衍生化法或液 液萃取法相比，操作簡單、處理時間短，能最大限度的保留糞便中的揮發(fā)性成分，不存在衍生化或提取的歧視效應(yīng)，減少處理過程中揮發(fā)性成分的損失，所用試劑安全易得，可用于人和大鼠糞便中揮發(fā)性脂肪酸的快速測定。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、材料與試劑

GC450 MS320型氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Varian公司），配有CombiPAL頂空進(jìn)樣器，Varian MS Workstation 6.92工作站；DB FFAP毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，美國Agilent公司）；Milli Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；AL 204 萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；SCIENTZ 25 12超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；pH 0.5～5.0和pH 5.5～9.0精密試紙（天津市塘沽區(qū)鵬達(dá)化工廠）。

乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、己酸、庚酸對照品（純度≥99%，美國Sigma公司）；H3PO4（>85%， 天津市光復(fù)精密化工研究所）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量上述7個對照品于10 mL容量瓶中，以6% H3PO4溶液定容，制成每1 mL含乙酸5.02 mg、丙酸2.58 mg、異丁酸4.53 mg、丁酸4.72 mg、異戊酸4.25 mg、己酸4.25 mg、庚酸5.97 mg的混合對照品溶液。

2.3 樣品處理方法

收集人和SD大鼠的新鮮糞便置于具塞廣口瓶中，于

80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩１狙芯坎捎玫拇笫蠹S便經(jīng)動物中心負(fù)責(zé)人審批后收集；研究用人糞便的收集經(jīng)自愿者同意并簽署了知情同意書。

2.4 HS GC/MS條件

2.4.1 頂空進(jìn)樣條件 頂空振蕩室加熱溫度：80 ℃；加熱時間：30 min；加熱方式：震蕩加熱；1.0 mL頂空進(jìn)樣針溫度：80 ℃；進(jìn)樣量：1 mL，不分流模式；用高純氬氣推動和清洗頂空針；清洗時間：0.5 min。

2.4.2 GC條件 DB FFAP色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）； 升溫程序：初始溫度50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦（He），純度>99.999%；流速：1.0 mL/min。

2.4.3 MS條件 電離方式：EI； 電子能量：

70 eV； 離子源溫度： 250 ℃；傳輸線溫度： 280 ℃；電子倍增器電壓： 0.95 kV； 全掃描模式， 掃描范圍m/z33～200。

2.5 數(shù)據(jù)處理

樣品中未知揮發(fā)性成分的定性分析：通過計(jì)算機(jī)檢索NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫得到化合物信息，統(tǒng)計(jì)R和F匹配度（其中，R匹配：樣品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索得到結(jié)果的相似度； F匹配：標(biāo)準(zhǔn)譜庫逆向檢索得到結(jié)果與樣品譜圖的相似度，兩者最大值均為1000）均大于700的揮發(fā)性成分。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品處理方法優(yōu)化

3.1.1 稀釋液的選擇 揮發(fā)性脂肪酸的極性較大、在水中易發(fā)生電離，在水溶液中以HA（游離型）和A

（離子型）兩種形式存在，兩者存在的量可以用分布系數(shù)（δ）表示，由解離常數(shù)Ka（或其負(fù)對數(shù)值pKa）和溶液的pH決定。當(dāng)用水作為稀釋液時，由于水的pH（～6.5）大于揮發(fā)性脂肪酸的pKa值（如甲酸pKa=3.74），因此揮發(fā)性脂肪酸主要以A

形式存在；若直接用HS GC/MS檢測，由于A

不易氣化，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低，甚至無法被檢出；當(dāng)改用酸作為稀釋液時，由于溶液的pH值較低，揮發(fā)性脂肪酸主要以HA形式存在，可以采用HS GC/MS進(jìn)行準(zhǔn)確分析。考慮稀釋液所用酸的揮發(fā)性及酸度對樣品的影響，故采用非揮發(fā)性中強(qiáng)酸（H3PO4）作為酸性調(diào)節(jié)劑。圖1為加H3PO4前后樣品的總離子流圖。由圖1可知，樣品用H3PO4稀釋液處理后，各揮發(fā)性脂肪酸的響應(yīng)均明顯提高。

3.1.2 酸度的選擇 根據(jù)一元酸分布系數(shù)各型體濃度的公式（δHA= H+H++Ka，δA

=KaH++Ka），當(dāng)溶液的pH=pKa-2時，δHA>99%；此外，對同系物脂肪酸而言，隨著碳鏈的延長，解離常數(shù)Ka呈降低趨勢，即pKa逐漸增加，

酸性不斷降低，如甲酸、乙酸、丙酸的pKa分別為3.74， 4.74， 4.87。綜上可知，當(dāng)溶液pH=2時，包括甲酸在內(nèi)的所有SCFA主要以游離態(tài)形式存在。考慮到溶液pH值對色譜柱、糞便樣品的影響以及揮發(fā)性脂肪酸在糞便中的含量，故調(diào)整溶液pH=2，這樣既可以保護(hù)色譜柱、避免糞便中揮發(fā)性脂肪酸的破壞，又能保證揮發(fā)性脂肪酸以游離型存在。不同濃度H3PO4溶液處理后大鼠糞便混懸液的pH值變化曲線見圖2。由圖2可知，糞便混懸液具有較強(qiáng)的緩沖能力，當(dāng)H3PO4溶液濃度為6%（V/V）時，糞便混懸液的pH=2。

3.2 糞便中揮發(fā)性成分HS GC/MS分析結(jié)果

按照2.4節(jié)所建立的HS GC/MS條件分析人、大鼠糞便及混合對照品溶液，圖3為人糞便樣品（圖3A）、大鼠糞便樣品（圖3B）和混合對照品（圖3C）的GC MS總離子流圖。通過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索、采用對照品比對以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析的方法，在人的糞便樣品中檢測到9種揮發(fā)性脂肪酸：乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸、己酸、庚酸；在大鼠糞便中檢測到8種揮發(fā)性脂肪酸：乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸。如圖4所示，以丁酸為例，列舉譜庫檢索結(jié)果及丁酸GC MS裂解規(guī)律。揮發(fā)性脂肪酸的GC MS譜庫檢索結(jié)果以及各成分通過峰面積歸一化法得到的相對百分含量的結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，人和大鼠糞便中揮發(fā)性脂肪酸的種類和相對百分含量基本一致，除了檢測到短鏈脂肪酸外，還檢測到少量的庚酸，其中乙酸、丙酸、丁酸是最主要的短鏈脂肪酸，約占揮發(fā)性脂肪酸總量的85%，與文獻(xiàn)＼[9]報(bào)道的結(jié)果基本一致，但戊酸、異己酸、己酸的相對百分含量差別較大，提示人和大鼠的腸道菌群具有較高的相似性，但仍存在物種間差異，與Chung等[2]的結(jié)論基本吻合。Chung等向無菌小鼠分別移植鼠和人的微生物群，檢測小腸免疫系統(tǒng)的成熟是否與宿主特異性微生物群有關(guān)。結(jié)果表明，鼠微生物群移植小鼠和人微生物移植小鼠的腸道細(xì)菌數(shù)量和門類具有相似性，但細(xì)菌種屬有些區(qū)別，特別是厚壁菌。

4 結(jié) 論

基于揮發(fā)性脂肪酸在腸道生態(tài)平衡中的重要性，本研究側(cè)重分析糞便中的揮發(fā)性脂肪酸，所建HS GC/MS法能夠系統(tǒng)分析糞便中揮發(fā)性脂肪酸，而文獻(xiàn)＼[12，15]僅關(guān)注糞便中部分揮發(fā)性脂肪酸的分析，如Gao等[12]采用GC MS對糞便水溶液氯甲酸乙酯化處理后的樣品進(jìn)行分析，更多關(guān)注的是糞便中一元羧酸、二元羧酸、酚類化合物、氨基酸等代謝產(chǎn)物，只檢測到4種揮發(fā)性脂肪酸（異戊酸、戊酸、己酸、庚酸）。綜上所述，本方法能夠系統(tǒng)地研究糞便中揮發(fā)性脂肪酸，方法簡單、靈敏，可用于人和大鼠糞便中揮發(fā)性脂肪酸的快速檢測。

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