蠶蛹蛋白腸內營養制劑干預2型糖尿病小鼠代謝特性的研究

趙清波，吳文惠，周 喻，朱長林，陳佳捷，張朝燕，包 斌，*

(1．上海海洋大學食品學院，上海201306;2．上海市第六人民醫院，上海201306;3．上海海洋大學海洋藥物與健康食品研究中心，上海201306)

蠶蛹(Silkworm pupa)為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾(Bombyx moil L．)的蛹，其資源豐富，蛋白營養全面均衡，干蠶蛹中含55%～60% 的粗蛋白［1］。蠶蛹蛋白(silkworm pupae protein，SPP)是一種較為理想的優質純天然全價蛋白質，含有18種氨基酸，占蠶蛹總氨基酸質量分數的35%，其中8種人體必需氨基酸含量高達42．20%，必需氨基酸與非必需氨基酸質量比優于WHO/FAO提出的氨基酸參考模式［2-3］，除此以外還富含核黃素、尼克酸、鋅、鐵、銅等營養素［4］。SPP是一種很好的藥用原料，現代醫學證明，SPP具有提高免疫力［5］、抗腫瘤［6］、抗疲勞［7］、降血壓［8］、降血糖［2］和降血脂［9］等功效，已上市的 SPP 類藥品有20多種，如血脂康、地奧血脂康等，其中瑞福康膠囊是中國第一個利用家蠶生產的基因工程口服蛋白質藥物［10］。SPP經酶水解、精制后所得到的蠶蛹肽能夠參與人體心腦血管系統的代謝，可有效清除血液中多余的膽固醇及脂類物質，達到軟化血管、降低血壓的作用［11］。蠶蛹肽還可應用于食品工業，作為食品添加劑改善觀感，調節口味，如用于氨基酸飲料中［12］，并作為食品營養強化劑在營養強化食品中使用［13］。作為寶貴的藥膳同源性昆蟲蛋白資源，近年來，國內外在SPP利用方面的研究也取得了突破性的進展［2］。鑒于SPP具有降血壓，降血糖、降低膽固醇等功效和免疫調節作用，其在特殊醫學用途食品的開發領域中也備受人們重視，為此，本實驗根據糖尿病人腸內營養(enteral nutrition，EN)制劑的配制要求和質量指標，將蠶蛹蛋白和蠶蛹短肽(silkworm pupae peptide，SPP)作為EN制劑的蛋白質來源，配制成糖尿病人專用的EN制劑，用于觀察該制劑干預2型糖尿病(Type 2 Diabetes mellitus，T2DM)小鼠代謝特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性昆明小鼠 購自上海斯萊克實驗動物有限公司(Slac laboratory animal)，體重在8～11g。動物合格證號:SCXK(滬)2012-0002。

高脂飼料 于上海斯萊克實驗動物有限公司定制，配方:豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，豬膽鹽 0．2% ，普通飼料 78．8%［14］。

鏈脲佐菌素(STZ) 購于美國 Sigma公司，-20℃保存，用 0．1mol/L，pH4．2～4．5 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液于冰中避光配制成2%的STZ溶液，0．2μm微孔濾膜過濾滅菌，現配現用。

蠶蛹蛋白質粉劑 由江蘇省南通福爾生物制品有限公司提供，生產批號:20130322。分為短肽1型、短肽2型和整蛋白型三種，其中短肽1型、2型樣品是根據邱英華等［15］雙酶法水解蠶蛹蛋白的方法，由脫脂蠶蛹粉末通過雙酶法(堿性蛋白酶和中性蛋白酶)水解得到蠶蛹短肽樣品，分子量為701．50u，整蛋白型樣品根據朱新鵬等［16］介紹的堿法提取蠶蛹蛋白的工藝制得白色無味蛋白質粉末，分子量為19586．03u，三種樣品的氨基酸組成分析見表 1［17］。

表1 蠶蛹蛋白和蠶蛹短肽樣品的氨基酸組成(g/100g)Table 1 Amino acid composition(g/100g)of three silkworm pupae protein and peptide samples(g/100g)

以SPP粉為蛋白源的自制EN制劑，每100g所含熱量為1968．42kJ，其中蛋白質供能比為20%、脂肪供能比為32．6%、碳水化合物供能比為45．7%，含膳食纖維9g(表2)。

表2 雅培益力佳SR與自制腸內營養粉劑主要營養成分比較(100g)Table 2 The comparison of main ingredient between Abbott Glucerna SR and SPP Enteral Formula(100g)

雅培益力佳SR營養配方粉 由雅培貿易(上海)有限公司生產，批號:6932904708741。每100g粉劑含424kcal(1772kJ)能量，其中蛋白質供能比為16．30%、脂肪供能比為37．59%、碳水化合物供能比為 42．22% 、含膳食纖維 3．46g。

京都GT-1640快速血糖測定儀 日本ARKRAY Factory，inc生產企業;京都GT-1640血糖試紙 日本國德島縣美馬市脅町大字豬尻字西上野110，生產批號:3H5A4S;壓片機 由Rimek公司提供，型號:Mini PRESS-ⅡSF;AU5800全自動生化分析儀 貝克曼庫爾特;水沖式籠具型號:M-5型(去底) 購自南京便診生物有限公司;其余設備均為實驗室常用儀器。

1.2 實驗方法

1．2．1 蠶蛹蛋白源腸內營養片劑的制備 將自制(分別以短肽1、短肽2和整蛋白型為蛋白源)腸內營養粉劑與市售雅培益力佳粉劑采用壓片機壓成中心厚度為5～7mm、質量約1g左右的片劑。

1．2．2 糖尿病小鼠模型建立 小鼠適應性飼養一周后，隨機選出10只作為對照組，普通飼料喂養，其余小鼠改用高脂飼料喂養，所有小鼠繼續喂養3周。第3周末禁食12h(晚9:00開始禁食，自由飲水)過夜左下腹腔注射STZ 40mg/kg BW，正常組注射等體積的0．1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，各組小鼠同等條件每天注射一次，連續注射3d。第4周末小鼠再次禁食12h(只禁食不禁水)，尾靜脈取血用快速血糖儀測定空腹血糖值。

1．2．3 實驗小鼠分組及腸內營養支持 記錄小鼠攝食量、飲水量，挑選具有多飲、多食、體質量下降、血糖值≥11．1mmol/L 的小鼠確定為實驗小鼠［18-20］，共50只，隨機分為5組，每組10只，分別為A組:空白組;B組:益力佳組，投與以雅培益力佳為蛋白源的EN片劑，每只/片/d;C組:短肽1組，投與蠶蛹短肽1蛋白源EN片劑，每只/片/d;D組:短肽2組，投與蠶蛹短肽2蛋白源EN片劑，每只/片/d及E組:蠶蛹蛋白組，投與以蠶蛹蛋白為蛋白源的EN片劑，每只/片/d，將包括F組(對照組)在內的所有小鼠均移至水沖式籠具喂養，小鼠均飲用足量去離子水，保持其環境干燥、清潔。

各組小鼠采用普通飼料繼續喂養4周，B、C、D、E四組每天早上9:00點投與對應EN片劑一次，其余時間自由飲水、攝食。

1．2．4 小鼠體重及空腹血糖值(FBG)測定 小鼠連續喂養28d，在給予EN片劑前(0d)，給片劑后7、14、21d和28d將對照組(F組)和糖尿病小鼠組(ABCDE)禁食過夜，只禁食不禁水。于次日早上9:00尾靜脈取血用快速血糖儀測定各組小鼠空腹血糖值(Fasting Blood Glucose，FBG)，并于禁食前一天稱量記錄小鼠體質量。

1．2．5 口服葡萄糖耐量(OGTT)實驗 糖尿病小鼠在EN片劑支持21d后，將A-F組小鼠禁食過夜，于第二天早上9:00投與EN片劑(空白組給予普通飼料)，60min后再灌胃給予50mmol/kg葡萄糖，用快速血糖測定儀測定小鼠灌胃前(0min)、灌胃后30、60和120min的血糖值，并計算葡萄糖耐量曲線下面積(Area Under Curve，AUC)(AUC=1/4(0min 血糖值)+1/2(30min血糖值)+3/4(60min血糖值)+1/2(120min血糖值))。

1．2．6 血清生化指標的測定 小鼠在EN片劑支持28d后，將各組小鼠禁食(自由飲水)過夜，于次日早上10:00用乙醚迷暈小鼠后背部大動脈取血，加入3．8%檸檬酸鈉溶液抗凝，3000r/min離心5min，取上清液送至上海市第六人民醫院(東院)用于血清生化指標的測定，使用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀檢測包括血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL)及低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL)含量，并計算HDL/TC值。

1．2．7 統計學處理 采用SPSS軟件(19．0版)對數據進行處理，所有計量資料采用均數±標準差(±s)表示，利用LSD法檢驗每組間的顯著性差異，p＜0．05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蠶蛹蛋白腸內營養制劑對糖尿病小鼠生活狀態的影響

對照組小鼠毛色光亮，活動頻繁，飲水攝食量正常;糖尿病小鼠毛發枯黃、光澤度下降，精神萎靡，出現多飲、多尿和體重下降，尿液粘度大，糞便呈稀溏狀，下腹部侵濕;食用SPP腸內營養片劑支持的 DM小鼠較食用益力佳EN片劑的DM小鼠毛色光澤度高，小鼠活動更為頻繁，墊料相對更為干燥。

2.2 蠶蛹蛋白腸內營養制劑對糖尿病小鼠空腹血糖(FBG)的影響

與對照組相比，空白組小鼠FBG水平顯著升高(p＜0．01)，且均高于 11．1mmol/L，說明 STZ 和高脂飼料誘導的小鼠T2DM造模成功。EN制劑支持前后DM小鼠FBG值變化見圖1。

圖1 腸內營養制劑支持前后糖尿病小鼠空腹血糖值(FBG)變化Fig．1 Effect of silkworm pupa protein Enteral Formula support on T2DM mice FBG index

空白組小鼠在最初的21d內FBG值仍持續緩慢升高，而實驗組小鼠在對應EN片劑支持后FBG值開始下降，短肽1組小鼠在EN支持一周后FBG值明顯下降(p＜0．05)，兩周后下降達極其顯著水平(p＜0．01)，在第四周小鼠血糖下降至9mmol/L，但各組數據組內差異較大。益力佳組小鼠血糖在最初一周也有小幅下降，但不顯著且一周后血糖值基本穩定在14mmol/L而無下降趨勢。其中，C、D、E 組 FBG 水 平 分 別 降 低 了 47．47%、38．14% 和41．52%，而 B 組僅下降了 22．38%，這表明以 SPP為蛋白源的EN制劑對DM小鼠降血糖功效較市售雅培益力佳更有效，且以短肽1型蛋白源EN制劑效果最為明顯。

表3 EN支持前后糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)變化Table 3 Effect of SPP Enteral Formula support on mice OGTT index

表4 蠶蛹蛋白腸內營養制劑對糖尿病小鼠血清指標的影響Table 4 Effect of SPP Enteral Formula support on T2DM mice Serum biochemical parameters

2.3 蠶蛹蛋白腸內營養制劑對糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)的影響

在EN片劑支持21d后，各組小鼠口服葡萄糖耐量實驗結果顯示(表3)，對照組小鼠在灌胃給予50mmol/kg葡萄糖溶液后，其OGTT值在最初30min內暫時上升至約9．0mmol/L，30min后血糖值開始下降，直至2h后血糖基本恢復至灌胃前水平。

與對照組相比，空白組小鼠在灌胃葡萄糖后30min的血糖值大幅升高，且在后續時間內恢復較慢，在120min時血糖仍遠遠高于灌胃前血糖值，食用短肽型EN片劑的小鼠較空白組小鼠血糖升高平緩，在灌胃30min后FBG值下降顯著(p＜0．05)，灌胃2h后血糖值基本恢復至灌胃前血糖值。益力佳組小鼠血糖值在較高水平上也有所下降，但灌胃30min后未出現顯著性，1h后血糖值下降顯著。

2.4 蠶蛹蛋白腸內營養制劑對糖尿病小鼠脂代謝的影響

蠶蛹蛋白EN制劑對DM小鼠脂代謝的影響見表4。

以SPP為蛋白源的實驗組在EN制劑支持4周后，TC值顯著降低(p＜0．01)，TG 與 LDL較空白組也有所降低，但無顯著性差異，其中短肽2組表現尤為明顯，該組數據在各指標中均最小，而益力佳組小鼠各指標較空白組除TC外變化均不明顯。HDL在短肽2組中有所下降(表4)，但相對TC的下降幅度要小。

3 結論與討論

糖尿病是嚴重危害人類健康的重大疾病，是遺傳因素與環境因素長期共同作用而導致的一種慢性、全身性、內分泌代謝性疾病［21］。當今世界已有DM患者2．46億，中國占有1億患者，居世界之首，患者中以T2DM占主導［22］。胰島素抵抗是T2DM發病的重要始因，本實驗結合國內外小鼠T2DM造模方法［23，18］，選用高脂飼料模擬肥胖 T2DM 患者發病初期的胰島素抵抗狀態，再通過多次小劑量注射STZ破壞胰島β細胞功能，加速DM的發生，最后誘發出高血糖癥。這種建模方式成膜率較高(70%)，但多次注射后小鼠各指標個體差異較大，以致分組后組內數據差異較大。

由于高血糖是T2DM的重要特點，長期以來對DM的治療以控制血糖為主要目標，本實驗FBG測定結果顯示，使用以SPP為蛋白源的EN制劑支持1周后即能顯著降低FBG值，持續EN支持四周后小鼠血糖值可下降至9～10mmol/L，但實驗組小鼠血糖值仍遠遠高于對照組，這源于本實驗在使用EN支持的同時，并未給小鼠胰島素注射或使用降血糖的藥物，EN支持制劑只能起到有效控制餐后或空腹血糖值、調節血脂代謝的效果，只是輔助營養治療而并不能代替藥物起到治療DM的作用。

近年來隨著對DM認識的深化，發現葡萄糖耐量實驗對于臨床診斷DM十分重要，是否改善糖耐量是評價藥物藥效的一個重要手段［24］。本實驗中口服葡萄糖耐量(OGTT)測量結果表明:給予以蠶蛹短肽1或蠶蛹短肽2為蛋白源EN制劑的小鼠在灌胃30min后血糖有小幅上升，而后顯著下降，在灌胃2h后小鼠血糖值基本恢復到灌胃前，這較益力佳組有更好的葡萄糖耐受度。

T2DM患者還常伴有脂代謝紊亂，表現為TG升高、HDL-C降低、LDL-C升高或正常，為此血脂代謝狀況也是評價T2DM病人病情的重要指標［21］。本實驗中，DM空白組小鼠即出現了高血脂癥及血脂代謝紊亂。實驗結果顯示，SPP蛋白源EN制劑明顯降低了糖尿病小鼠的TC、TG及LDL水平。但本實驗使用的外源性引起的T2DM小鼠高血脂模型與人類內源性DM高血脂模型存在一定的差異，因此本實驗中自制EN制劑對血脂不同成分的影響及機理需要進一步研究。

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