擬青霉FLH30胞內β-葡萄糖苷酶特性研究

華承偉，于江傲，李 蘭，常景玲，張志宏

(河南科技學院生科院，河南新鄉453003)

β-葡萄糖苷酶能夠將纖維二糖水解成葡萄糖，從而解除纖維素在酶解過程中產生的纖維二糖對纖維素酶的抑制作用［1］，所以，在纖維素的水解中起著非常重要的作用。β-葡萄糖苷酶也是一類具有重要生理功能的水解酶，能催化氧親合糖基轉移的水解酶，在一些條件下可催化芳基、氨基、或烷基-β-D-糖苷以及生青糖苷、短鏈低聚糖和二糖中的糖苷鍵，此外，在特定的條件下會發生水解的逆反應，生成一些新的糖苷［2］。β-葡萄糖苷酶在食品中不僅可以用于改良果汁風味、果酒增香、茶葉增香、生產大豆異黃酮活性苷元、去除苦澀物質［3-4］，而且，可用于酵母提取物的生產和海藻生物轉化生產可發酵葡萄糖，利用其轉移活性應用于低聚糖和糖綴合物合成等。此外，在日用化工業、醫藥行業中也有廣泛的用途［5］。

β-葡萄糖苷酶按存在的部位，可分為胞內和胞外2種，根據氨基酸序列相似性，β-葡萄糖苷酶分別隸屬于糖苷水解酶家族1和3［6-7］。家族1中的β-葡萄糖苷酶來自于細菌、植物和哺乳動物，家族3中的β-葡萄糖苷酶主要來自于真菌、細菌和植物。幾乎所有的β-葡萄糖苷酶對底物的糖基部分結構的專一性較差，能裂解 C-O、C-S、C-N、C-F等鍵，有些對糖基部分的C4和C2構形也不專一，能同時水解β-葡萄糖苷鍵和β-半乳糖苷鍵，甚至對C6位的專一性也不高，能夠水解木糖苷［8］。本實驗對分離得到的耐熱真菌擬青霉FLH30進行細胞破碎，并經凝膠層析和離子交換得到的電泳級β-葡萄糖苷酶純酶進行性質探索，為該酶的基因克隆及利用提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 Paecilomyces sp.FLH30，河南科技學院分離工程實驗室保存。

發酵培養基(g/L) 酵母提取物10，蛋白胨10，葡萄糖 20，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl20.4，FeSO4·7H2O 0.1，pH，自然;酵母提取物、蛋白胨Oxoid公司(英國);大麥葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖、木聚糖、pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-α-D-葡萄糖苷、pNP-β-D-半乳糖苷、ONP-β-D-半乳糖苷、纖維二糖、龍膽二糖和乳糖 Sigma公司(美國);纖維寡糖(G3～G4) 自制;丙烯酰胺、甘氨酸、Tris Biomol公司(美國);Sephacryl-S-100HR Pharmacia公司(美國);DEAE52 Whatman公司(英國);低分子量蛋白質標準 TaKaRa公司(日本);葡萄糖氧化酶試劑盒 北京北化康泰化學試劑有限公司;其它試劑均為分析純。

超聲波超微細胞破碎儀 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司;TU-1800PC紫外可見分光光度計北京普析通用儀器設備有限責任公司;Power Pac BasicTM型電泳儀 BIO-RAD公司(美國);GL-20B高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;Kieselgel 60層析板 Merck公司(德國);核酸蛋白層析系統上海滬西儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液制備 取搖瓶發酵培養5d的培養物，3000r/min離心 10min，去除上清，菌絲體用適量50mmol/L pH6.0的磷酸緩沖液重懸，冰浴條件下超聲(300W)，工作 3s，停 5s，循環 100 次，破碎液經10000r/min 4℃冷凍離心 10min，取上清，即為粗酶液。

1.2.2 酶的純化及分子量檢測 粗酶液經Sephacryl-S-100 HR凝膠層析(1×100cm，流速1mL/min)，收集有酶活性的部分，經超濾濃縮后，再用50mmol/L pH6.0的 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液透析過夜，經DEAE52離子交換(1×10cm，上樣及平衡緩沖液同透析緩沖液，含有100mmol/L NaCl的緩沖液洗滌3～5個柱體積，100～500mmol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫，流速 3mL/min)，1mL/管，分步收集后，SDSPAGE電泳［9］分別檢測酶蛋白純度(分離膠和濃縮膠分別為5%和12.5%)，收集有酶活且純度較高的部分，經超濾濃縮和4℃冷凍離心后，取上清4℃保存，作為實驗用酶材料。

Sephacryl-S-100HR凝膠過濾法測定分子量以磷酸化酶B(97.4ku)、牛血清蛋白(66.2ku)、兔肌動蛋白(43.0ku)、牛乳酪蛋白(25.0ku)和細胞色素C(12.4ku)作為標準蛋白。按公式Ve=-b'lgMw+c'，通過lgMw對Ve做圖，從曲線上求出分子量。

1.2.3 蛋白含量測定 參照Lowry等的方法［10］，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.2.4 酶活測定 于試管中加入75μL用蒸餾水配制的 15mmol/LpNPG底物，然后加入 150μL 75mmol/L，pH6.0磷酸檸檬酸緩沖液，混勻，使底物終濃度為5mmol/L，緩沖液濃度為50mmol/L，50℃預熱3min，然后加入25μL適當稀釋的酶液，反應10min后，加入750μL飽和四硼酸鈉溶液終止反應，冷卻后測定A405，以pNP作標準計算酶活力。酶活力的單位定義為:在上述條件下，每分鐘生成1μmol pNP所需要的酶量。

1.2.5 最適反應pH和pH穩定性 45℃下，將緩沖液分別換成不同pH及不同體系(Na2HPO4-Citric，2.5 ～ 6.5;NaH2PO4-Na2HPO4，6.0 ～ 8.0;CHES，8.0～11.0;Na2HPO4～NaOH，11.0～12.0;KCl～NaOH，12.0～13.0)的緩沖液加入到底物中，然后按照標準方法測定酶活力，以酶活力最高點作為100%，確定最適pH;用上述不同的pH緩沖液分別稀釋純酶液，將稀釋好的酶液置于25℃水浴鍋中分別處理30min，迅速將樣品置于冰水中冷卻30min，然后測定殘余酶活力，以未經處理的酶液作為對照，計算殘余酶活力的百分比，考查pH穩定性。結果為三次實驗數據的平均值。

1.2.6 最適溫度和溫度穩定性 將重組酶適當稀釋于50mmol/L pH6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，然后分別在30～70℃不同溫度下按照上述方法測定酶活力。溫度穩定性測定:將酶液用50mmol/L pH6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液稀釋后分別在不同的溫度下處理30min，然后置于冰水浴中冷卻30min，最后按標準的方法測定殘余酶活力，以未經處理的酶液酶活力為100%對照。結果為三次實驗數據的平均值。

1.2.7 金屬離子及化合物對酶活力的影響 在緩沖液為50mmol/L，pH6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液的酶溶液中分別加入不同的金屬離子，使其終濃度為4mmol/L，將酶液在25℃下處理 30min，然后在50℃條件下測定剩余酶活力，以沒有添加金屬離子的酶液作為對照。結果為三次實驗數據的平均值。

1.2.8 底物特異性 分別以pNP-糖苷、二糖、低聚糖和聚糖為反應底物測定酶活力。pNP-糖苷類底物以水解釋放出 pNP的速率來計算酶活力，采用50mmol/L，pH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制5mmol/L濃度的底物，然后在50℃下反應10min，最后測定405nm的吸光度值;低聚糖用50mmol/L，pH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制10mg/mL濃度的底物，然后在50℃下反應10min，最后通過檢測水解過程中釋放出葡萄糖的速率來計算酶活力。葡萄糖的濃度采用葡萄糖氧化酶試劑盒測定;聚糖類底物用50mmol/L，pH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制成1%(w/v)濃度，然后在50℃下反應10min，最后采用DNS法測定水解過程中釋放的還原糖量。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘反應生成1μmol pNP、葡萄糖或還原糖所需要的酶量。然而，對于低聚糖中的纖維二糖和龍膽二糖，一個酶活力單位為生成2μmol的葡萄糖的量(水解一個糖苷鍵釋放出兩個葡萄糖)。所有的實驗均經過三次重復。

1.2.9 聚糖和纖維多糖水解TLC分析 以50mmol/L，pH6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制10%的纖維多糖和1%的大麥葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖，添加10U/mL的重組酶，50℃保溫水解，定時取樣進行薄層層析(TLC，Kieselgel60)分析，展層系統為正丁醇/乙酸/水系統(2∶1∶1，v/v/v)，將水解的樣品點樣后展開兩次，吹干后用硫酸∶甲醇(5∶95，v/v)溶液浸濕，最后在130℃烘箱中烘烤顯色。

2 結果與討論

2.1 糖苷酶純化及分子量測定

經Sephacryl-S-100HR凝膠層析和DEAE52離子交換，收集純度較高的部分再經SDS-PAGE檢測(上樣10μg)，達到電泳級純酶(圖1)。

圖1 純化β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE電泳檢測列Fig.1 Analysis of purified β-glucosidase by SDS-PAGE

微生物胞內β-葡萄糖苷酶一般屬于1家族糖苷水解酶，分子量較小，而胞外糖苷酶大多屬于3家族糖苷水解酶，分子量較大，且由于β-葡萄糖苷酶的糖基化作用，分子量一般在100～250ku之間［11］。SDS-PAGE電泳結果顯示為單一條帶蛋白，分子量在44.3～66.4ku之間，為確定在活性狀態下該酶的分子量，凝膠過濾法測定了其分子量，根據凝膠過濾標準蛋白分子量曲線(圖2)，測定活性狀態下的β-葡萄糖苷酶分子量為57.2ku，對比SDS-PAGE電泳結果，該酶應為1家族糖苷水解酶且為單亞基蛋白。

圖2 凝膠過濾測β-葡萄糖苷酶標準曲線Fig.2 The curve of gel filtration chromatography of standard protein

2.2 最適反應pH和pH穩定性

該葡萄糖苷酶的最適pH約為6.0，pH對其活性影響較大，pH低于5.0，嚴重抑制酶活性，在pH4.5時，只有最高酶活的12%，當pH高于6.5時，酶活性也急劇下降(圖3a);該酶在pH5.0～12.0(圖3b)范圍內比較穩定，處理30min后，殘余酶活力仍保持在80%以上。

2.3 最適溫度和溫度穩定性

在不同溫度下測得酶活性數據顯示該酶最適反應溫度60℃左右，超過65℃，酶活性快速下降(圖4a);該酶在70℃以下處理30min非常穩定，超過70℃后，酶活性快速喪失，85℃處理30min，只有原酶活性的12.5%。

2.4 金屬離子及化合物對酶活力的影響

圖3 β-葡萄糖苷酶最適pH(a)和pH穩定性(b)Fig.3 The optimal pH(a)and pH stability(b)of β-glucosidase

圖4 β-葡萄糖苷酶最適溫度(a)和溫度穩定性(b)Fig.4 The optimal temperature(a)and temperature stability(b)of β-glucosidase

部分金屬離子及化合物處理數據顯示(表1)，Ag+、Hg2+和Fe3+強烈抑制酶活性，Zn2+有較強的抑制作用。其它金屬離子對酶活沒有顯著的影響。其中，EDTA對酶活沒有顯著影響，表明金屬離子不是酶的必需輔助因子，SDS，DTT和β-巰基乙醇對酶活也沒有顯著影響，說明二硫鍵不是維持酶正常空間構象的必需作用力。

2.5 底物特異性

該胞內葡萄糖苷酶具有較寬的底物作用范圍(表2)，對 pNP-(-D-半乳糖苷、ONP-β-D-半乳糖苷和纖維二糖有較高的比活力。此外，對部分聚糖也有水解能力，可以水解地衣多糖、昆布多糖和大麥葡聚糖，但不能水解木聚糖和羧甲基纖維素。該酶作用底物及糖苷鍵型比較廣泛，預示該酶具有較廣的用途。

表2 葡萄糖苷酶底物特異性Table 2 Analysis of substrate specificity of β-glucosidase

表1 金屬離子及其它化合物對β-葡萄糖苷酶的影響Table 1 The metal ions and other chemicals influence on β-glucosidase

2.6 聚糖和纖維多糖水解TLC分析

大麥葡聚糖、昆布多糖、纖維三糖和纖維四糖的水解實驗表明，水解大麥葡聚糖、昆布多糖沒有見到低聚寡糖的生成，產物主要以單糖為主(圖5)，可能以外切的方式作用于這些聚糖;此酶可以完全水解纖維三糖和四糖，在4h后基本完全降解為單糖，同時，水解過程中伴隨著轉糖苷作用，這種轉糖苷作用在最初的2h內較為明顯，1～2h之間在二糖和三糖之間有一新糖生成，可能為龍膽二糖，但隨水解時間增加，逐漸水解為單糖(圖6)。

3 結論

圖5 TLC分析β-葡萄糖苷酶水解大麥葡聚糖和昆布多糖Fig.5 Analysis of β-glucosidase hydrolysis of barley glucan and laminarin by TLC

圖6 TLC分析β-葡萄糖苷酶水解纖維三糖和四糖Fig.6 Analysis of β-glucosidase hydrolysis of cellotriose and cellotraose by TLC

依據水解底物特異性的不同可將β-葡萄糖苷酶劃分成β-葡萄糖苷酶、纖維二糖酶和具有較寬水解特異性，能夠水解多種不同底物的β-葡萄糖苷酶三類。本擬青霉FLH30為耐熱真菌［12］，胞內β-葡萄糖苷酶作用底物廣泛，應屬于第三類β-葡萄糖苷酶。1家族β-葡萄糖苷酶最適溫度一般在40～50℃之間，該β-葡萄糖苷酶最適溫度60℃，在此溫度下處理30min，酶活損失小于10%，70℃處理30min，酶活損失也小于20%。不同來源β-葡萄糖苷酶pI一般都在酸性范圍內(3.5～5.5)，并且差別不大，最適pH也多在酸性范圍內且最適作用pH范圍較窄，本β-葡萄糖苷酶最適pH6.0，在pH4.5以下，酶活性急劇下降，但該酶非常耐堿，在pH12.0處理30min后，殘余酶活力仍保持在70%以上，預示該酶在食品、醫藥、紡織、能源等方面具有較大潛在應用價值。

［1］Hong J，Tamaki H，Kumagai H.Cloning and functional expression of thermostable β-glucosidase gene from Thermoascus aurantiacus［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，73:1331-1339.

［2］Mohamed G，Issam S.Fungus β-glycosidases:immobilization and use in alkyl β-glycoside synthesis［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2004，29:89-94.

［3］JeyaM，JooAR，LeeKM，etal.Characterization of β-glucosidase from a strain of Penicillium purpurogenum KJS506［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，86:1473-1484.

［4］Zhou C，Qian L，Ma H，et al.Enhancement of amygdalin activated with β-d-glucosidase on HepG2 cells proliferation and apoptosis［J］.Carbohydrate Polymers，2012，90:516-523.

［5］潘利華，羅建平.β-葡萄糖苷酶的研究及應用進展［J］.食品科學，2006，27(12):803-806.

［6］Henrissat B，Callebaut I，Fabrega S，et al.Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93(17):9302.

［7］Ketudat CJR，Esen A.β -Glucosidases［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2010，67(20):3389-3405.

［8］Driskill LE，Bauer MW，Kelly RM.Synergistic interactions among beta-laminarinase，beta-1，4-glucanase，and betaglucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus during hydrolysis of beta-1，4-，beta-1，3-，and mixedlinked polysaccharides［J］.Biotechnol Bioeng，1999，66(1):51-60.

［9］Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4［J］.Nature，1970，227:680-685.

［10］Lowry O H，Rosebrough N J，Farr A L，et al.Protein measurement with the folin phenol reagent［J］.Journal of Biological Chemistry，1951，193:265-275.

［11］Nakkharat P，Haltrich D.Purification and characterization of an intracellular enzyme with β -glucosidase and β -galactosidase ac tivity from the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus CBS236.58［J］.Journal of Biotechnology，2006，123(3):304-313.

［12］華承偉，于江傲，謝鳳珍，等.耐熱 β-1，3(4)-葡聚糖酶源真菌篩選、鑒定及產酶條件優化［J］.食品工業科技，2012，33(13):131-134.