不同分子量水牛乳酪蛋白酶解肽抗氧化活性的研究

李玲，曾慶坤，林波，唐艷，農(nóng)皓如，黃麗，謝芳

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧530001)

0 引言

制備高含量的活性肽產(chǎn)品，開發(fā)高營養(yǎng)、易吸收且具有生物學(xué)活性的乳肽產(chǎn)品，是乳品研究開發(fā)的重要方向[1-2]。活性肽的分離純化是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，超濾膜分離是通過選擇一定截留分子量大小的超濾膜，對(duì)多肽的分子量進(jìn)行初步分級(jí)，以得到一定分子量范圍的多肽。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制的水牛乳酪蛋白酶解粗多肽進(jìn)行透析脫鹽，并根據(jù)其分子量分布，超濾得到不同分子量范圍的肽組分，測定不同分子量范圍肽的抗氧化活性，以明確高活性肽的分子量范圍，為純肽段的分離純化及鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

DPPH（Sigma-Aldrich），Tris（Solarbio），鐵氰化鉀，三氯化鐵，鹽酸，鄰二氮菲，無水乙醇，七水合硫酸化亞鐵，過氧化氫，EDTA，鄰苯三酚，磷酸二氫鈉，三氯乙酸均為分析純。水牛乳酪蛋白粗多肽1號(hào)，堿性蛋白酶酶解肽，實(shí)驗(yàn)室自制。MWCO100D透析袋（美國光譜），MSC300超濾杯以及超濾膜，紫外分光光度計(jì)（美國Perkin Elmer）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 脫鹽及超濾分級(jí)流程

整體試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程如圖1所示。由圖1可以看出，對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制的水牛乳酪蛋白酶解粗多肽1號(hào)進(jìn)行透析脫鹽，得到脫鹽后的多肽2號(hào)，測定多肽2號(hào)的分子量分布，選擇適宜的超濾膜，超濾后得到多肽3號(hào)以及多肽4號(hào)，測定不同分子量范圍肽組分的抗氧化活性。

圖1 脫鹽及超濾分級(jí)流程

2.2 脫鹽方法

將粗多肽1號(hào)配制成10%的溶液置于MWCO 100D透析袋中，浸泡在去離子水中于4℃下透析，每2 h換一次水，24 h后，將其進(jìn)行冷凍干燥得到多肽2號(hào)樣品。

2.3 分子量分布測定方法

采用高效液相色譜法，參考陳園園等[3]。

2.4 超濾方法

將多肽2號(hào)配制成5%水溶液，在超濾杯中安裝超濾膜，控制壓力，超濾過程保持最大工作壓力0.22 MPa，得到不同分子量范圍的多肽。收集濾出液并濃縮、冷凍干燥，得到多肽3號(hào)與多肽4號(hào)。

2.5 抗氧化活性測定方法

（1）清除DPPH自由基的能力參考李玲等[4]方法。

（2）清除羥基自由基的能力參考陳學(xué)勤等[5]方法。

（3）清除超氧陰離子的能力參考汪建斌等[6]方法。

（4）還原能力參考Oyaizu等[7]的方法。

3 結(jié)果與分析

3.1 透析脫鹽

透析的目的是對(duì)得到的粗多肽進(jìn)行簡單的純化，降低由于鹽的存在而對(duì)超濾分級(jí)和抗氧化活性實(shí)驗(yàn)的影響。透析實(shí)驗(yàn)后得多肽2號(hào)的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.62%，相比于粗肽1號(hào)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.91%，脫鹽率為82.96%，此時(shí)多肽2號(hào)的肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于80%。

3.2 多肽2號(hào)分子量分布

測定水牛乳多肽2號(hào)的分子量范圍，為超濾分級(jí)中超濾膜的選擇提供數(shù)據(jù)參考。多肽2號(hào)的分子量分布如圖2與表1所示。由圖2和表1可以看出，99.9%的肽分子量小于3 ku，其中小于2 ku的達(dá)到99.14%，大于1 ku的達(dá)到89.04%，說明本實(shí)驗(yàn)室自制的水牛乳酪蛋白酶解肽，水解充分，得到的肽分子量較低。根據(jù)多肽2號(hào)的分子量分布情況，選擇截留分子量為1 ku的超濾膜對(duì)不同分子量的多肽進(jìn)行超濾分級(jí)，得到分子量小于1 ku和大于1 ku（1～3 ku）的兩個(gè)組分，命名為多肽3號(hào)和多肽4號(hào)。

圖2 多肽2號(hào)分子量分布

3.3 各分子量范圍肽組分抗氧化活性

天然產(chǎn)物的抗氧化活性需采用多種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，而使用自由基捕獲體系，通常選用2-3種不同的自由基體系來考察抗氧化劑的自由基捕獲能力，本研究采用了DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和超氧陰離子清除能力，結(jié)合還原能力，測定對(duì)比2.5，5.0，10.0，20.0 mg/g不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，多肽3號(hào)與多肽4號(hào)的抗氧化能力，并以強(qiáng)抗氧化劑維生素C以及酶解肽的乳源蛋白，即水牛乳酪蛋白為對(duì)照。

表1 多肽2號(hào)分子量定量分布

圖3 DPPH自由基清除能力的比較

圖4 羥基自由基清除能力的比較

圖5 超氧陰離子清除能力的比較

圖6 還原能力的比較

清除DPPH自由基能力的測定結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，清除能力的大小依次為Vc＞多肽3號(hào)＞多肽4號(hào)＞酪蛋白。除羥自由基能力的測定結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，清除能力的大小依次為多肽3號(hào)＞Vc＞多肽4號(hào)＞酪蛋白，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20 mg/g時(shí)，多肽3號(hào)的清除率達(dá)到94.78%，遠(yuǎn)大于酪蛋白，甚至高于Vc。超氧離子清除率的測定結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，清除率大小依次為：Vc＞多肽3號(hào)＞多肽4號(hào)＞酪蛋白，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/g時(shí)多肽3號(hào)的清除率達(dá)到50.33%，相比于抗壞血酸明顯偏低。還原能力測定結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗氧化劑中，還原能力大小依次為Vc＞多肽3號(hào)＞多肽4號(hào)＞酪蛋白，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/g時(shí)，小于1 ku多肽的A值達(dá)到1.0091，水牛乳多肽的還原能力介于Vc和酪蛋白之間，其還原能力明顯高于酪蛋白，且分子量范圍越小，還原能力越大。

抗氧化活性測定結(jié)果表明：水牛乳酪蛋白酶解肽對(duì)DPPH自由基以及羥基自由基的捕獲能力較強(qiáng)，對(duì)清除超氧離子的捕獲能力相對(duì)較弱，其中多肽3號(hào)抗氧化活性高于多肽4號(hào)，且通過方差分析質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/g時(shí)各分子量肽組分與酪蛋白抗氧化活性的差異，表明二者各抗氧化指標(biāo)均顯著（P＜0.05）高于底物酪蛋白。董江濤等人[8]研究表明，分子量分布在1 ku以下的大豆多肽抗氧化能力表現(xiàn)較高，原因可能是小分子的多肽活性位點(diǎn)或基團(tuán)更多地暴露在外，能充分與自由基等結(jié)合，所以多肽分子量的大小與抗氧化性有密切的聯(lián)系。目前已經(jīng)從乳蛋白酶解物中分離得到的純肽段的分子量也多在1 ku以內(nèi)，如，Suetsuna K等[9]得到的 YFYPEL，F(xiàn)YPEL，YPEL，PEL，EL 肽段；Contreras等[10]得到的LQKW，LDTDYKK肽段，劉志東等[11]得到的HIR肽段。本研究對(duì)不同分子量范圍的水牛乳酪蛋白酶解肽的抗氧化活性研究也表明，分子量在1 ku以內(nèi)的肽段，其DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除能力以及還原能力均明顯強(qiáng)于分子量在1 ku以上的肽段（1～3 ku）。

4 結(jié)論

制備的水牛乳酪蛋白酶解肽分子量均小于3 ku，通過超濾對(duì)多肽分子量分級(jí)后，分子量在1 ku以內(nèi)的水牛乳酪蛋白酶解肽，其DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除能力以及還原能力均強(qiáng)于分子量在1 ku以上的肽段（1～3 ku），且顯著高于（P＜0.05）酶解前的底物酪蛋白。

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