異色瓢蟲HSP67B2 基因的克隆及誘導表達分析

鄔夢靜，沈祺達，施佐堃，王世貴，唐 斌

(杭州師范大學動物適應與進化重點實驗室，杭州 310036)

熱激蛋白(Heat Shock Protein，HSP)又稱熱休克蛋白或應激蛋白(Heat Stress Protein)(王建義和慈忠玲，2008)。1962年Ritassa 首次在從果蠅中發現(Ritassa，1964)，1974年Tissieres 證實這組蛋白質并將其命名為 HSP(Tisseres and Mitchell)。相關研究表明，昆蟲體內熱激蛋白的表達量越高，其耐熱性就越強(Le et al.，2001;Murphy et al.，2003)。熱激蛋白不僅在熱刺激時大量表達，在其它環境脅迫下如低溫、高滲透壓及重金屬等因素也能大量表達(孫旭彤等，2002)。按照其相對分子量、結構和功能，可以分為以下幾大類:HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSPl00 和低分子量家族(陳莉，2012)。小分子熱激蛋白(sHSP)家族的分子質量在15-30 kD 之間，是廣泛存在于原核生物和真核生物體內的一類分子伴侶(王瑞嫻等，2010)，能在外界脅迫時大量表達，幫助抵抗逆境。

異色瓢蟲Harmonia axyridis Pallas，屬鞘翅目Coleoptera，多食亞目 Polyphage，瓢蟲科Coccinellidae，肩突瓢蟲族Synonychini，和瓢蟲屬Harmonia(姜文虎，2007)。異色瓢蟲在俄羅斯阿爾泰山脈以東的廣大地區及薩哈林島、庫頁島、中國、蒙古、朝鮮、日本等地均有分布，又稱為亞洲瓢蟲(杜波，2007)。作為一種重要捕食性昆蟲資源，異色瓢蟲是許多害蟲的天敵，主要對蚜蟲、蚧殼蟲、粉蚧、木虱、螨類以及某些鱗翅目、鞘翅目害蟲的卵和低齡幼蟲具有控制作用，特別是對蚜蟲的生物防治效果較好(Korch，2003)。同時，異色瓢蟲作為瓢蟲科中比較常見的種類，具有食量高，產卵量大，抗逆性強等特點(申智慧，2011)，因而其在生物防治方面具有良好的應用前景，并且可有效減少農藥對環境和生物的危害。我國是農業大國，富含異色瓢蟲資源，在異色瓢蟲的開發利用方面具有明顯的優勢和較大的空間。目前國內外對異色瓢蟲HSP 的抗逆性研究較少，且多針對于模式生物，其作用機理也要用進一步探討。既然異色瓢蟲適應能力強、擴散能力光，能適應不同的惡劣條件，本研究探索HSP67B2 在抗逆中的表達模式。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲源和實驗種群的飼養

在25±1℃，濕度為70±5%條件下建立異色瓢蟲試驗種群。具體飼養方法為:將異色瓢蟲成蟲放入方形塑料養蟲盒(15 cm×12 cm×7 cm)中，每盒20 頭-30 頭，每天飼喂1 次蠶豆蚜Aphis medicaginis，蟲盒以紗布封蓋。在養蟲盒中放入有褶皺的紙條，作為瓢蟲的產卵基質。待雌蟲產卵后，將卵移至養蟲籠(鋁合金+60 目紗網，45 cm×30 cm×30 cm)中繼續飼養，每日提供足量蚜蟲作為食物繁殖3 代后，取異色瓢蟲進行試驗。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器與設備

試驗中主要用到的具體儀器和設備包括，常規冰箱(西門子KK25V61TI)、-80℃冰箱(艾本德U410-86)、恒溫水浴鍋(上海精宏DK-8D)、高壓蒸汽滅菌鍋(Hiclave HVE-50)、臺式高速離心機(Sigma 1-14)、臺式低溫離心機(艾本德)、實時熒光定量PCR 儀(BioRAD CFX96)、無菌超凈工作臺(ESCO)、電子分析天平(梅特勒-托利多AL204)、移液器(艾本德)和微量測定分光光度計(NanoDropTM2000)。

1.2.2 主要試劑與藥品

DNA Marker DL2000、6×Loading buffer、cDNA 一鏈反轉錄試劑盒、T 載體等購自大連Takara 公司;提取總RNA 用Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司;PCR 引物由上海Invitrogen 公司合成;3'和5'RACE 試劑購自Clonetech;膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司產品;實時熒光定量PCR 試劑盒購自美國Bio-RAD 公司;氯仿、異丙醇、無水乙醇、EDTA 等常規試劑均購自Sigmma 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA 抽提及一鏈cDNA 合成

采用Trizol 法抽提(Chomczynski and Sacchi，1987)異色瓢蟲脂肪體的總RNA 后，用瓊脂糖凝膠電泳測定RNA 的純度并利用微量核酸測定儀定量RNA 的濃度。取1μg 總RNA 作為模板，利用AMV 反轉錄試劑盒合成一鏈cDNA。

1.3.2 3' 與5' cDNA 末端快速擴增(Rapid amplified of cDNA end，RACE)

本實驗室曾將一批異色瓢蟲材料送至深圳華大基因科技有限公司進行轉錄組測序，得到測序結果后將序列翻譯成蛋白序列，在NCBI 庫中進行比對，發現有一條序列為異色瓢蟲的HSP67B2 基因的中間片段。采用 SMART RACE cDNA amplification kit 建立異色瓢蟲脂肪體組織的3'與5'RACE 文庫。根據1.2.2 獲得的中間序列，分別設計兩對特異性引物(見表1)，并進行PCR。具體PCR 條件為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環，72℃充分延伸5 min。反應結束，取5μL PCR 產物在1.2% 瓊脂糖凝膠上電泳。當檢測到目的條帶后，進行回收純化，然后連接到T 載體中，進行驗證后，送上海英駿公司測序部測序。

1.3.3 不同齡期異色瓢蟲HSP67B2 基因的表達

采用熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，QRT-PCR)法測定，取異色瓢蟲不同齡期幼蟲及成蟲(蛻皮或羽化2 h 后)為試驗對象，采用相對QRT-PCR 法測定HSP 基因相對表達量。根據異色瓢蟲HSP 67B2 基因保守區域設計引物探針(見表1)，并根據異色瓢蟲18S基因設計內參引物與探針(見表1)。提取異色瓢蟲不同齡期蟲體總RNA(方法同上)，每個齡期重復3 頭并且重復3 次，用凝膠電泳和紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度，取1μg 總RNA 量為進行一鏈cDNA 反轉錄。取反轉錄產物1μL 用于熒光定量PCR，每個處理重復3 次。QRT-PCR 按照Real-Max(probe)試劑盒體系進行熒光定量PCR，具體PCR 程序為94℃預變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸30 s，40個循環，在68℃收集熒光信號，采用2-ΔΔT法進行數據分析。

1.3.4 不同溫度條件下異色瓢蟲HSP67B2 基因的表達

不同溫度分別處理:在人工智能培養箱(Sanyo，MLR-361H，日本)中，對其分別進行-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃處理1 h。升溫處理:設定人工智能培養箱溫度為-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、25℃梯度，首先將異色瓢蟲置于-5℃保持1 h，之后轉入0℃保持1 h，依次將異色瓢蟲轉移至5℃、10℃、15℃、25℃。上述實驗進行三次重復，每個處理重復5-10 頭。分別將上述各處理的異色瓢蟲進行液氮研磨，抽提RNA，并參照1.3.3 的方法進行QRT-PCR，測定異色瓢蟲HSP67B2 基因的相對表達量。

1.3.5 不同饑餓時間下異色瓢蟲HSP67B2 基因的表達

在人工智能培養箱中，對其進行饑餓處理，分別取0 h，4 h，8 h，12 h，18 h，24 h 的異色瓢蟲，實驗重復3 次，每個處理重復5-10 頭，抽提RNA，并參照1.3.3 的方法進行QRT-PCR，測定HSP67B2 基因的相對表達量，定量結果用2-ΔΔT法進行數據分析

1.2 序列分析及數據分析

序列分析和系統分析分別采用 Dnastar、Vector、Compute pI/Mw 和ClustalW 等，在線分析網址:http:∥expasy.org/tools/#translate，NetNGlyc 1.0 Server:http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/;TMHMM Server v.2.0:http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/和 ClustalW:http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html，用 于在線分析昆蟲HSP67B2 基因同源性。另外使用MEGA 5.05 軟件，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建進化樹，Bootstrap 設定為1 000 次重復。其它數據分析均采用Statistica 6.0 進行分析。

2 結果與分析

2.1 異色瓢蟲熱激蛋白基因cDNA 全長的克隆及分析

3' 與5'RACE 比對拼接后得到了異色瓢蟲HSP67B2 基因 cDNA 全長序列(序列登錄號:KJ155728)，并從兩端設計引物，能夠直接擴增出全長片段，測序后發現跟拼接序列一致。HSP67B2基因全長626 bp，其中翻譯氨基酸數140個，3'非翻譯區為81 bp，5'非翻譯區為122 bp，等電點為6.61，預測蛋白分子量為15.97 KD(圖1)。

圖1 異色瓢蟲HSP67B2 基因cDNA 序列Fig.1 The cDNA sequence of Harmonia Axyridis HSP67B2

表1 試驗中所用的引物Table 1 Primers used in the experiments

圖2 不同昆蟲HSP67B2 基因蛋白序列比對結果與分析Fig.2 Alignment of the deduced amino acid sequences of HSP67B2 gene in insects

2.2 昆蟲的HSP67B2 基因同源性和進化分析

目前，NCBI 上已經有多條關于昆蟲的HSP67B2 基因報道，從中挑選了有代表性的物種:意大利蜜蜂 Apis florae、黑脈金斑蝶 Danaus plexippus、赤擬谷盜Tribolium castaneum、黑腹果蠅Drosophila melanogaster 和點蜂緣蝽Riptortus pedestris與異色瓢蟲采用Multiple 進行比對分析結果發現，不同昆蟲的HSP67B2 基因相差較大。

將已知昆蟲的HSP67B2 基因的蛋白序列進行系統進化分析，結果表明異色瓢蟲和赤擬谷盜雖然同屬于鞘翅目，但是不聚在同一枝，這表明昆蟲HSP67B2 基因可能具有多種類型，目前已有研究的是一種基因類型，本實驗通過轉錄組得到另一種基因類型(圖3)。

2.3 不同齡期異色瓢蟲HSP67B2 基因相對表達量測定

異色瓢蟲不同齡期HSP67B2 基因表達量存在差異。以幼蟲一齡為對照，在不同齡期異色瓢蟲HSP67B2 基因表達量普遍低于對照，其中幼蟲期HSP67B2 基因的表達量相對較高，蛹期表達量最低，成蟲期較蛹期升高，說明其在幼蟲期需要儲存更多的熱激蛋白(圖4)。

圖3 異色瓢蟲的HSP67B2 與相關蛋白的聚合進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of HaHSP67B2 and other related proteins

圖4 不同齡期異色瓢蟲HSP67B2 相對表達量Fig.4 The relative expression level of HaHSP67B2 in different instars

2.4 短時低溫處理下異色瓢蟲HSP67B2 基因相對表達量測定

取異色瓢蟲成蟲，分別置于-5℃，0℃，5℃，10℃，15℃(CK)，25℃處理1 h 之后以15℃為對照，測定HSP67B2 基因的相對表達量。結果如圖5 所示，低溫處理下異色瓢蟲HSP67B2基因的表達量普遍低于其在25℃時的水平，然而在10℃時量明顯升高，與其他溫度差異顯著。

圖5 不同溫度分別下異色瓢蟲HSP67B2 基因的表達水平Fig.5 The expression level of HaHSP67B2 gene under the the treatment of different temperature respectly

升溫處理異色瓢蟲，以-5℃為對照測定相對表達量發現，在經歷瞬時低溫沖擊時，HSP67B2基因的表達量顯著較高，之后HSP67B2 基因的表達量顯著的下降，在5℃又顯著上升。后隨著溫度的上升，其表達量逐漸上升(圖6)。說明在前期的誘導下顯著提高了HSP67B2 基因的表達，此時昆蟲體內合成了較多的熱激蛋白，可以滿足其在一定時間內的生理需要，所以表達量低于正常水平，而隨著時間的推進其表達量逐漸上升。

圖6 升溫處理下異色瓢蟲HSP67B2 基因的表達水平Fig.6 The expression level of HaHSP67B2 gene under the treatment of decreasing temperature

2.5 饑餓處理下異色瓢蟲HSP67B2 基因相對表達量測定

圖7 饑餓處理下異色瓢蟲HSP67B2 基因的表達水平Fig.7 The expression level of HaHSP67B2 gene under the the treatment of starvation

饑餓處理異色瓢蟲，在0 h，4 h，8 h，12 h，18 h，24 h 分別取樣后，以0 h 為對照測定饑餓處理下異色瓢蟲HSP67B2 的相對表達量。結果表明，HSP67B2 表達量呈現上升后下降的趨勢，在12 h前表達量逐漸上升，12 h 達到最大，18 h 顯著下降，24 h 又略有上升(圖7)。說明饑餓8 h 前異色瓢蟲并未感到外界刺激，8 h 時其感受到強烈饑餓刺激，提高了HSP67B2 基因的表達，滿足其生理需要。饑餓18 h 表達量較低，可能是12 h 表達合成的小分子熱激蛋白足以滿足其一段時間的生理需要，而隨著時間的推進其表達量逐漸上升。

3 結論與討論

自Ritossa 在果蠅中發現熱休克蛋白以來，其研究已經有了較大的進展。研究表明，熱激蛋白廣泛存在于微生物和動植物體內，是一個蛋白質超家族，可以按照其相對分子量、結構和功能分為多類(陳莉，2012)。HSP 作為一類重要的分子伴侶，參與蛋白的折疊、降解以及細胞內物質的運輸等過程，調節靶細胞的活性，卻不參與靶蛋白的合成(黃惠芳和馬飛，2004)。另有研究表明HSP 家族可以通過介入細胞凋亡信號通路從而影響細胞凋亡，其在細胞凋亡的過程中主要起著兩種不同并且看似完全相反的作用:一，HSP 能抑制細胞凋亡，促進細胞的存活;二，HSP 作為某些關鍵凋亡蛋白的分子伴侶，促進細胞凋亡(武斌等，2011)。盡管HSP 序列保守，編碼序列變異比較低，但近期已有研究表明，熱激蛋白基因序列存在變異，而且此類變異可能與生物體對溫度的適應性存在某些相關性(韓政等，2010)。小分子熱激蛋白(sHSP)家族，分子質量在15-30 kD之間(王瑞嫻等，2010)，是一個非常多樣的群體，不同的組織有著不同數目的sHSP，分子量也有相當大差異(李斌等，2004)，甚至在同一種內，也能觀察到相當多的多樣性，并在序列上也有一定差異(Mansfield and Key，1987)。目前已發現了由5個不同的核基因亞家族編碼20 多種sHSP，并且不同家族之間sHSP 的N 端有較大的分化(陳亞瓊等，2006)。不同的sHSP 在昆蟲滯育期間具有不同功能作用(Theodoros Gkouvitsas et al.，2008)，并且在不同強度的刺激下也有不同的應激程度(Huang et al.，2009)。研究表明sHSP 的表達可能在某些激素的產生和熱激調控系統中起到功能的聯系作用，其對昆蟲組織的再生和發育也具有一定作用(Huang et al.，2009)。部分熱激蛋白能夠單獨發揮其功能，如蝶蛹金小蜂純化的重組Pphsp20，在一定程度上能抑制高溫引起的熒光素酶聚集，再次證明sHSP 能夠阻止高溫下蛋白質的聚集，同時也能幫助變性的熒光素酶復性(王歡等，2012)。

本次研究發現HSP67B2 在幼蟲期間高表達，并且在四齡幼蟲第二天時有一個高峰期。四齡幼蟲時期是異色瓢蟲生長的一個重要階段，之所以會在此階段出現高表達可能是幼蟲即將蛹化導致。但是在其他昆蟲中卻出現在四齡幼蟲期低表達的現象(Jiang et al.，2012;Li and Du，2013)。在饑餓刺激中，發現在饑餓8 h 時HSP67B2 相對表達量最高，饑餓刺激對昆蟲而言是一個復雜的刺激因素，可包括能量和身體內穩態水鹽平衡等(Benoit et al.，2009;Wang et al.，2012)，而相關研究報道饑餓8 h 時，異色瓢蟲的運動速度較快，停頓次數少且運動距離長(Tang et al.，2014)，表明饑餓8 h 其需要尋找食物，導致體內產生熱量，HSP67B2 基因在8 h 的高表達也正好驗證了這一點(圖5)。

熱激蛋白的研究是當今細胞生物學、生物化學中一個重要研究領域，其中心問題是熱激蛋白的生物學功能(孫旭彤等，2002)。研究證明昆蟲中的小分子蛋白與植物中的存在明顯進化差異，對熱激蛋白等應激基因的進化、功能以及作用機制的研究能促進昆蟲對不同環境的適應性的研究(Li et al.，2009)，也可應用與藥物開發、疾病免疫和環境監測等(王建義和慈忠玲，2008)。Staempfth 等研究認為，一些土壤污染物可以誘發昆蟲體內產生熱激蛋白，通過測定土壤昆蟲的熱激蛋白就可診斷該土壤的污染狀況(Staempfli et al.，2002)。HSPS 是生物體中一種重要的應激物，在應對亞致死冷、熱刺激，疾病，環境污染和饑餓等惡劣條件時都起重要作用(Feder et al.，1997)，在其正常生命活動受到制約時能表達HSP 應對刺激(Colinet et al.，2010)，通過研究熱激蛋白和昆蟲應對熱刺激環境時的關系，在進一步研究昆蟲適應環境溫度變化上有重大意義。并且熱激蛋白在異色瓢蟲等天敵昆蟲利用方面具有很大潛力，在天敵昆蟲方面熱激蛋白的研究將為天敵的保存和利用提供理論依據和基礎，推動我國農業發展。

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