橙皮素及橙皮苷與牛血清白蛋白作用的比較

鄒淑君，張蕾，郭迎喜，于子惠，許樹軍，馬英麗

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃酮類化合物有廣泛的藥理活性，被吸收到血液里往往與血清蛋白發生相互結合而達到運送和分布的目的［1］。黃酮與蛋白結合作用的程度、強弱、位點等因素都可能影響它們的吸收、運輸、釋放及藥效等。因此，探索黃酮類藥物與蛋白質相互識別部位的結構特征及構效關系，有助于深入認識黃酮發揮藥理作用的機理、藥物代謝及藥效等相關問題。

橙皮素(Hesperetin)是一種二氫黃酮，在自然界多以連接一個蕓香糖的橙皮苷(Hesperidin)的方式存在。橙皮素和橙皮苷都存在于很多植物中，是中藥材陳皮中的重要有效成分。具有廣泛的生理活性［1］，如雌激素樣活性、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗血小板凝聚、舒張血管、抗動脈粥樣硬化及抗炎等作用［2-4］(結構式見圖1)。本文采用多種光譜法測試二者與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，從作用機制、作用強弱、作用力類型、結合距離等測試它們與BSA作用的差異，并分析黃酮類物質A環7位羥基是否糖苷化對與BSA作用的影響。

圖1 橙皮素和橙皮苷的結構式

1 試劑與儀器

RF-5301PC型熒光光度計(日本島津公司);UV-1601PC型紫外可見分光光度計(日本島津公司);PB-20型pH計(德國賽多利斯儀器有限公司)。

橙皮素及橙皮苷(均為98%，上海晶純實業有限公司)，二者分別用少量甲醇溶解后，再用二次蒸餾水定容，配成1×10-4mol/L的溶液;三羥甲基氨基甲烷(Tris，99.8%，上海博宏生物科技有限公司);牛血清白蛋白(BSA，99.8%，美國Sigma公司)，用pH值7.4的Tris-HCl緩沖液(含0.1mol/L NaCl)配成1×10-5mol/L，4℃保存。

2 實驗方法

2.1 熒光猝滅光譜

分次取0～1000μL的橙皮素或橙皮苷溶液(每次間隔100μL)加入到盛有1.0ml BSA(1.0×10-5mol/L)溶液的10ml容量瓶中，用Tris-HCl(pH=7.40)緩沖液定容。進行3次上述操作，分別置于290K、300K、310K水中溫浴15min后測定，固定激發波長280nm，掃描290～450nm范圍內的熒光光譜(激發狹縫均為5nm，發射狹縫均為3nm)。

2.2 紫外-可見吸收光譜

室溫下，以pH=7.4的Tris-HCl緩沖液為參比，在200～450nm范圍內，分別掃描BSA溶液(1.0×10-6mol/L)、二氫黃酮溶液(1.0×10-6mol/L)和二氫黃酮與BSA(均為1.0×10-6mol/L)混合溶液的紫外光譜。

圖2 橙皮素和橙皮苷對BSA的熒光猝滅光譜

3 結果與討論

3.1 熒光猝滅光譜

圖2為300K時，不同濃度的橙皮素或橙皮苷溶液存在下BSA的熒光發射光譜。由圖2可見，二者都能明顯猝滅BSA的內源熒光，且引起BSA的最大熒光發射波長紅移，橙皮素存在下，紅移2～3nm;橙皮苷存在下，紅移1～2nm。紅移表明氨基酸殘基周圍所處微環境親水性增加，極性增強［5］。

在290nm～450nm范圍內，橙皮素和橙皮苷在實驗濃度下均無熒光發射，所以不需考慮“內部濾光效應”的干擾，則定義熒光猝滅率為η。

F0和F分別是加入化合物前后BSA的熒光強度，在實驗濃度范圍內二者對BSA的熒光猝滅率見圖3。可見，同濃度的橙皮素對BSA的猝滅程度明顯比橙皮苷大，表明A環7位羥基糖苷化會降低對BSA的熒光猝滅效率。

圖3 橙皮素和橙皮苷對BSA的熒光猝滅效率

3.2 熒光猝滅機理

熒光猝滅通常以動態猝滅或靜態猝滅為主。動態猝滅由猝滅劑和熒光物質的激發態分子之間的碰撞引起，猝滅常數隨溫度的升高而增大;靜態猝滅由猝滅劑與熒光物質形成不發光的配合物引起，猝滅常數隨溫度的升高而減小。動態猝滅過程可根據 Stern-Volmer方程描述［6］。

式中F0和F分別為未加入和加入化合物時BSA的熒光強度，Kq為雙分子碰撞猝滅常數，它反映體系中分子的彼此擴散和相互碰撞對生物大分子熒光壽命衰減速率的影響，且各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅常數為2.0×1010L/(mol·s)。［Q］為猝滅物質濃度。Ksv為Stern-Volmer猝滅常數，它描述熒光物質與猝滅劑分子彼此擴散和相互碰撞達到動態平衡時的量效關系。τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的熒光壽命，對于生物大分子［10-11］τ0=10-8s。

若假設所考察的兩種黃酮對BSA是動態猝滅，以(F0/F-1)對［Q］進行線性擬合，斜率就是Ksv，進而求得Kq，相應數據見表1。由表1可見，橙皮素、橙皮苷對BSA猝滅的Kq均大于2.0×1010L/(mol·s)，橙皮素猝滅BSA的Ksv隨著溫度的升高而減小，而橙皮苷猝滅BSA的Ksv隨著溫度的升高呈現不規律性變化。因此認為橙皮素對BSA的熒光猝滅不是動態猝滅，而是由于形成了復合物所引起的靜態猝滅;橙皮苷對BSA的熒光猝滅既包含動態猝滅，也存在靜態猝滅。

表1 橙皮素和橙皮苷與BSA作用的Ksv、Kq、Ka及n

圖4 BSA-橙皮素及BSA-橙皮苷體系的紫外可見吸收光譜

3.3 紫外-可見吸收光譜

熒光動態猝滅影響到熒光體的激發態，而不改變熒光物質的吸收光譜，靜態猝滅往往生成基態復合物，會導致熒光物質吸收光譜改變［6］。為進一步確定橙皮素和橙皮苷對BSA的熒光猝滅機理，考察了體系的紫外可見吸收光譜，見圖4。

圖4中譜線a是BSA的吸收峰，主要由色氨酸和酪氨酸芳雜環的π-π*和n-π*躍遷引起;譜線b是橙皮素或橙皮苷的吸收;c線是等濃度橙皮素/橙皮苷與BSA混合體系的吸收譜。由圖4可見，橙皮素與BSA等濃度混合后，導致BSA在278nm處的最大吸收峰略紅移。BSA也使橙皮素在320nm以后的吸收略紅移;橙皮苷與BSA等濃度混合后，基本未導致BSA在278nm處的最大吸收峰發生移動。BSA使橙皮苷在320nm以后的吸收略紅移，且有輕微增色效應。因此，進一步認為橙皮素對BSA的猝滅機理以靜態猝滅為主;橙皮苷對BSA的猝滅機理以動態猝滅為主，但同時含有靜態猝滅。

3.4 結合常數和結合位點數

小分子藥物對蛋白質大分子的靜態猝滅體系中，結合常數Ka及結合位點數n可以用下面的雙對數方程式來推導［6-7］。

固定BSA的濃度，改變橙皮素或橙皮苷的濃度，以lg［(F0-F)/F］對 lg［Q］作圖可得直線，由直線的斜率及截距可分別求得不同溫度下反應的結合常數Ka及結合位點數n，相關數據見表1。由表1可知，BSA與橙皮素的結合常數Ka數值為104量級，結合位點數小于1，與橙皮苷的結合常數Ka數值為103～104量級，結合位點數大于1。說明這兩種化合物可以被BSA儲存和運輸。并且同溫度下，橙皮素與BSA結合程度明顯大于橙皮苷與BSA結合的程度。

3.5 熱力學參數和作用力類型

根據Ross等人的研究結果的分析方法，大致判斷橙皮素及橙皮苷與BSA之間的作用力類型。在290～310K范圍內二者與BSA作用的ΔG、ΔH及ΔS見表2。由表2可見，二者與BSA結合，均有ΔG＜0，表明它們與BSA的作用過程均為Gibbs自由能降低的自發過程。橙皮素與BSA的作用過程是ΔH＜0，ΔS＜0，表明氫鍵和范德華力是橙皮素與BSA間的主要作用力。對于橙皮苷與BSA的作用過程有:△H＞0，△S＞0，表明疏水作用力是橙皮苷與BSA的主要作用力［6-8］。

表2 橙皮素及橙皮苷與BSA作用的熱力學參數及依據非輻射能量轉移理論計算的結合距離

圖5 橙皮素及橙皮苷的紫外吸收與BSA熒光光譜的重疊譜

3.6 作用距離

根據F?ster能量轉移理論，運用如下關系式就可以求出小分子在BSA上的結合位點與BSA分子中產生熒光的基團之間的距離r［8］。

其中E是能量轉移效率;R0為E=50%的臨界距離;F0和F分別為未加入和加入化合物時BSA的熒光強度;K2為偶極空間取向因子，一般取給體與受體各向隨機分布的平均值2/3;n為介質折射常數，取水和有機物的平均值1.336;為BSA的熒光量子產率，通常取色氨酸的量子產率0.15;J為給體熒光發射光譜與受體吸收光譜的重疊積分;F(λ)是熒光給體在波長λ處的熒光強度;ε(λ)是受體在波長λ處的摩爾吸光系數.根據公式(6)求出J，代入公式(5)求出R0，再根據公式(4)求出r。如果r＜7nm，就認為發生了非輻射能量轉移［8］。

圖5為300K，濃度為1.0×10-6mol/L的橙皮素或橙皮苷的紫外吸收光譜與1.0×10-6mol/L的BSA的熒光光譜的重疊圖譜，相關數據計算結果見表2。

由表2可見，兩種黃酮小分子在BSA上的結合位點與蛋白質分子中的色氨酸殘基的距離均有r＜7nm，具備了能量轉移猝滅蛋白質熒光的條件，因此非輻射能量轉移也是二者引起BSA熒光猝滅的原因之一。橙皮素與BSA的結合位點與色氨酸殘基的距離明顯比橙皮苷與BSA的結合位點與色氨酸距離小，所以可以說明橙皮素與BSA色氨酸殘基結合得更緊密。

4 結論

總結兩種二氫黃酮對BSA的熒光猝滅率、猝滅常數、結合常數、結合位點數、作用距離等可以說明，黃酮A環7位羥基糖苷化導致與BSA之間的親和力減弱，作用距離增大，且影響與BSA間的結合位點數及作用力類型。因此，橙皮素與BSA的結合能力明顯強于橙皮苷，說明橙皮素比橙皮苷更容易被血清蛋白貯存和運輸。也表明黃酮A環7位羥基是否糖苷化直接影響其與BSA相互作用的強度和結合力的方式。這在二氫黃酮及苷作為藥物或食品添加劑使用時，從生物利用度、作用機理和代謝過程等方面考慮有重要的參考意義。

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