半枝蓮多糖對肝癌小鼠差異表達蛋白質影響的實驗研究

于水瀾，于英君，許曉義，關利新，劉佳維，朱雁飛，宋高臣

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2．牡丹江醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 157011)

半枝蓮(Scutellaria barbata D．Don)為唇形科黃芩屬植物，味辛、微苦，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒，散癖止血，利尿消腫、抗癌等功效［1］，是中醫(yī)處方和成藥中的常用中藥。近代藥理學研究表明，半枝蓮具有抗腫瘤［2－4］、抗氧化［5］、抗病毒［6］、抑菌［7］、解熱［8］、保肝［9］等活性。半枝蓮作為一種常用的抗腫瘤中藥，現(xiàn)代在臨床上應用于治療肝癌、胃癌、肺癌、直腸癌、鼻咽癌等且療效確切［10］。其中半枝蓮多糖(SB-PS)是從半枝蓮中分離的主要功能性成分之一。

本實驗運用蛋白質組學技術中的2－DE與圖像分析技術，將SBPS作用H22肝癌小鼠后的血清與腫瘤組血清分別進行分離和比較分析，通過比對分析找出差異表達的蛋白，為進一步篩選出SBPS抑制腫瘤活性的靶位蛋白奠定基礎。

1 實驗材料

1．1 動物與廇株

昆明種小鼠20只，體質量(20±2．0)g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供;小鼠轉移性腹水型肝癌細胞株(H22)，由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所引進。

1．2 主要試劑

半枝蓮多糖(寧波德康生物制品有限公司);固相pH梯度干膠條(7cm，pH值3～10);固相pH梯度干膠條(18cm，pH 值4～7);IPG Buffer、覆蓋液、等電點標準、甘油(Glycerol);2D Qunat Kit蛋白定量試劑盒、溴酚藍(Bromophenol blue)均由 GE Amersham Biosiences公司提供;ProteoExtractTMAlbumin/IgG Removal Kit(Calbiochem 公司);DTT、IAM、TEMED、CHAPS、β－巰基乙醇等(Sigma公司);其他試劑均為標準實驗試劑。

1．3 主要儀器

680 分光光度計(Bio－Rad公司);3K15高速離心機(Sigma公司);純水裝置(Millpore公司);Ettan DALT twelve system電泳儀、Ettan IPGphor3等點聚焦儀、ImageMaster 5．0 分析軟件(GE Amersham Biosiences公司);PowerLook 2100XL掃描儀(UMAX Powerlook公司)。

2 實驗方法

2．1 H22肝癌小鼠實驗模型建立與分組

無菌條件下抽取接種第6～7天的生長良好的H22肝癌小鼠的腹水(活癌細胞數(shù)＞97%)，生理鹽水1:3稀釋，0．2%臺盼藍染色，計活細胞數(shù)大于95%，無菌操作小鼠右前肢腋部皮下接種0．2mL/只制備實體瘤模型。將接種H22細胞的實體瘤小鼠隨機分為兩組，每組10只，分別為腫瘤組和SBPS組。于接種6h后開始腹腔注射給藥，SBPS組100mg/(kg·d)，腫瘤組小鼠給予同體積的生理鹽水。每日1次，直到腫瘤組腫瘤達到lg以上。

2．2 血清樣品制備

小鼠摘眼球取血，取完血后4℃靜置30min，然后以3000g離心20～30min，取上清，同組血清樣品混合后，分別將兩組血清分裝置于－80℃冰箱保存。利用ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit對血漿樣品進行去除白蛋白和免疫球蛋白(實驗步驟按照操作說明書)。用2－D Quant Kit進行蛋白濃度測定(實驗步驟按照操作說明書)，得上清液為蛋白樣本。

2．3 雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳(2－DE)操作步驟按應其使用說明進行;取兩組小鼠血清(SBPS組和腫瘤組)蛋白樣品，進行第一向固相pH梯度等電聚焦，平衡膠條，再進行第二向SDS－PAGE電泳，重復兩次。

2．4 圖像掃描及分析

雙向電泳凝膠采用UMAX公司的PowerLook 2100XL掃描儀進行掃描，運用GE Amersham公司的ImageMaster 5．0軟件對凝膠數(shù)據(jù)進行分析。

2．5 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS 13．0軟件，組間蛋白的差異點采用卡方檢驗，組間蛋白點匹配率的比較采用T－test檢驗。

3 結果

3．1 血清2－DE的重復性

在相同條件下，分別對腫瘤組和SBPS組血清進行兩次2－DE圖譜的重復性匹配分析，腫瘤組和SBPS組兩塊膠圖斑點的匹配率分別為99.85%和99.81%，此實驗可獲得重復性較好的血清2－DE圖譜。

3．2 腫瘤組和SBPS組血清的2－DE圖譜

腫瘤組和SBPS組血清的2－DE圖譜(見圖1)總蛋白質點分別為(335±3)、(252±7)個。應用 ImageMaster 5．0軟件分別對兩組2－DE圖譜進行匹配分析后，腫瘤組與SBPS組間蛋白表達差異3倍以上的點共有18個(見圖2)，其中在SBPS組中6個蛋白點表達上調，1個蛋白點表達下調，1個蛋白點在SBPS組特異表達，10個蛋白點在SBPS組表達缺失，如表1～2所示。

表1 腫瘤組與SBPS組表達量相差3倍以上的蛋白質點

圖1 腫瘤組(左)和SBPS組(右)蛋白表達圖譜

圖2 腫瘤組與SBPS組2－DE凝膠圖譜中的差異蛋白點

表2 腫瘤組與SBPS組特有的蛋白質點

4 討論

多糖作為一種重要的天然大分子物質，其抗腫瘤藥理作用已經(jīng)得到肯定［11－12］。半枝蓮多糖(Scutellaria barbata Polysaccharides，SBPS)是從半枝蓮中分離的主要有效成分之一。張秀娟等［13］研究表明，半枝蓮多糖在體內對S180肉瘤的生長有一定的抑制作用，宋高臣等［14］研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮多糖能夠抑制小鼠HepA腫瘤生長，增加免疫器官重量。但半枝蓮多糖對肝癌的抑制作用機制鮮見報道，還有待進一步研究。

雙向凝膠電泳技術作為蛋白質組學研究的核心技術之一，廣泛應用于尋找腫瘤發(fā)生發(fā)展相關蛋白的研究中。實驗對比分析兩組血清蛋白的2－DE圖譜，腫瘤組與SBPS組蛋白表達發(fā)生了改變的有18個，在SBPS組有6個蛋白點表達上調，1個蛋白點表達下調，1個蛋白點在SBPS組特異表達，10個蛋白點在SBPS組表達缺失。這些蛋白可能是癌基因或抑癌基因產(chǎn)物，或者部分蛋白可能是潛在的癌基因或潛在的抑癌基因產(chǎn)物，SBPS通過上調抑癌基因的表達、下調癌基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的增殖或者誘導腫瘤細胞凋亡。SBPS組特有的蛋白質點所對應的蛋白質有可能是細胞出現(xiàn)的新的抑癌基因表達的產(chǎn)物，它們可能是SBPS作用的靶蛋白，由于SBPS的誘導表達發(fā)揮抗腫瘤增殖作用。

以上說明SBPS對肝癌的治療是通過多靶點調節(jié)共同作用的，其對肝癌的治療或許與改變這些蛋白質點的表達相關。已發(fā)現(xiàn)的這些差異或特異表達的蛋白質究竟是已知蛋白還是新蛋白，可通過質譜鑒定、氨基酸的序列分析和數(shù)據(jù)庫檢索等方法，還需要進一步確認。

［1］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典［S］．北京:化學工業(yè)出版社，2005:77－78．

［2］ 林敬明，劉煜，羅榮城，等．半枝蓮抑制人肝癌QGY－7701細胞增殖研究［J］．南方醫(yī)科大學學報，2006，26(5):591－593．

［3］ 祝勇軍，張春容，曹倫．半枝蓮抗腫瘤作用研究進展［J］．中國中醫(yī)急癥，2006，15(5):533－535．

［4］ Dai ZJ，Wang XJ，Li ZF，et al．Scutellaria barbate extract induces apoptosis of hepatoma H22cells via the mitochondrial pathway involving caspase－3［J］．World Journal of Gastroenterology，2008，14(48):7321－7328．

［5］ 楊容，黃志，習洋，等．中藥半枝蓮中黃酮類化合物的抗氧化活性［J］．河北大學學報(自然科學版)，2007，27(5):489－491．

［6］ 佟繼銘，劉玉玲，陳光暉，等．野黃芩甙的解熱作用研究［J］．承德醫(yī)學院學報，1999，16(2):101－103．

［7］ 龍盛京，羅佩卓．17種清熱中藥抗活性氧作用的研究［J］．中草藥，1999，30(10):40．

［8］ 金燕辛，卞益民，徐曉梅．復方半枝蓮注射液藥效學實驗研究［J］．首都醫(yī)藥，2000，7(9):32．

［9］ 張春玲，胡峻峰，曲江斌，等．Ames試驗檢測幾種中草藥及綠茶的抗誘變作用［J］．衛(wèi)生毒理學雜志，2002，16(1):66．

［10］ 潘敏求，何日恒．中華腫瘤治療大成［M］．石家莊:河北科學技術出版社，1996:144．

［11］ 董志偉，喬友林，李連弟，等．中國癌癥控制策略研究報告［J］．中國腫瘤，2002，11(5):250－260．

［12］ 于英君，劉佳維，于水瀾，等．樹舌多糖GF對肝癌細胞E2F1基因表達及細胞增殖的抑制作用［J］．中醫(yī)藥學報，2013，41(2):9－12．

［13］ 張秀娟，楊姍姍．半枝蓮多糖體內抗腫瘤及其免疫調節(jié)作用的實驗研究［J］．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2008，4(2):54－56．

［14］ 宋高臣，于英君，王喜軍．半枝蓮多糖的抗腫瘤作用及其調節(jié)免疫的實驗研究［J］．世界科學技術－中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13(4):641－643．