傳統中草藥高通量測序技術RNA－seq及lncRNA挖掘的應用策略

白晶，李力恒，孫堯，扈韻綺，付博

(1．黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2．黑龍江省農業科學院博士后科研工作站，東北林業大學博士后科研流動站，黑龍江 哈爾濱 150086;3．黑龍江省農業科學院畜牧研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

中藥成分的藥理學及化學研究已很成熟，但其天然活性成分的調控機理、生物合成途徑的研究才剛起步。未來中醫藥發展的主要方向，是運用次生代謝工程手段研發生產中藥，對于中草藥次生代謝產物合成途徑及其調控機制的闡明尤為重要。

然而，由于大多數中草藥為非模式生物，很多中草藥的生長、發育、次生代謝等生物學過程中的分子機制尚未得到詳細闡述，大多數藥用植物基因組信息缺乏，遺傳信息和功能基因的研究滯后，尤其是對以上過程中的功能基因挖掘明顯滯后于模式植物，這嚴重阻礙了傳統中醫向現代中醫的發展。因此，對傳統中草藥重要功能基因的挖掘成為當務之急。

轉錄組代表細胞或組織內全部RNA轉錄本，包括編碼蛋白質的mRNA和各種非編碼RNA(microRNA、lncRNA等)。后基因組時代，轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構，對解決生物學功能研究、基因進化、遺傳育種以及生態多樣性等諸多方面的問題具有重要意義，現已廣泛應用于臨床診斷和藥物研發［1］。藥用植物次生代謝產物生物合成關鍵酶基因的發現，次生代謝途徑的闡明，轉錄組學研究顯示了重要的應用價值。RNA－seq作為新興的高通量測序技術以其成本低，速度快，精確度高等優勢逐漸應用到轉錄組的研究中［2－3］。近期，作為非編碼RNA的lncRNA逐漸得到了研究人員的重視，并認為lncRNA在基因表達調控中發揮重要作用，廣泛參與生理活動和疾病過程［4］。

應用RNA－seq技術挖掘傳統中草藥中若干重要長非編碼RNA(lncRNA)可為闡明中草藥的生長、發育、次生代謝等生物學過程中的分子調控機制奠定理論基礎。本文將對中草藥RNA－seq技術研究策略及lncRNA挖掘方法做簡要綜述。

1 RNA－seq技術用于中草藥轉錄組研究的優勢

通過單基因研究策略不能很快揭示中草藥天然活性成分生物合成途徑，亟需采用高通量方式在整體水平上全面分析基因組和功能表達之間的聯系。因此，從RNA水平研究中草藥在特定生長時期和培養條件下全基因組轉錄情況可揭示基因編碼RNA(mRNA)和非編碼RNA(Non－codingRNA，ncRNA)的表達水平及其調控規律，進一步推動中草藥基因功能和ncRNA調控機制的研究。上一代轉錄組研究方法主要通過基因芯片技術、基于傳統sanger測序法的SAGE技術(serial analysis of gene expression)、LongSAGE技術、MPSS(massively parallel signature sequencing)等。其中，基因芯片技術應用較廣。但與RNA－seq研究方法相比，基因芯片技術存在以下缺陷:

1)基因芯片的精確度依賴于探針的數量和重疊度，使得基因芯片的成本大大增加。

2)由于基因芯片是通過判斷雜交信號的強弱來間接反映轉錄本表達水平，因此容易受到背景信號和交錯雜交的干擾，也不能用于低豐度轉錄本的檢測(細胞內低豐度的ncRNA往往具有重要的調控作用并發揮重要生物學功能)。

3)基因芯片法必須有相應物種的基因組序列作參照［5］。

因此該方法只能用于基因組序列已知的物種的轉錄組分析，使得缺乏基因組序列參照的傳統中草藥轉錄組研究舉步維艱。

RNA－seq測序剛剛發展起來，它利用深度測序方法進行轉錄組分析，該技術正在改變著轉錄組研究的方式，它具有以下優勢:

1)在轉錄組水平上發現SNP。識別一個基因不同的轉錄本和可變剪切位點。

2)無需設計特異性的探針。可以無研究物種基因信息，直接對任何物種的轉錄組進行分析。

3)以更高的分辨率和覆蓋度對細胞內所有轉錄本進行直接檢測。

4)能夠檢測未知基因和發現新的轉錄本。

5)測序成本大大降低。

目前，有Illumina公司(Genome Analyzer II)、ABI公司(ABSOLiD)、Roche公司(454 GS－FLX)三大公司是比較大規模平行測序(Massive parallel sequencing，MPS)的技術平臺。這三個平臺各有優勢，其中，Illumina公司的Genome Analyzer II平臺通過文庫構建、錨定橋接、PCR擴增、單堿基延伸測序等步驟實現高通量測序過程，該平臺具有高準確性、高通量、高靈敏度和低運行成本等突出優勢，是目前使用最廣泛的新一代測序平臺。ABI公司的ABSOLiD平臺具有讀取精確度高和數據輸出量大和低成本等優勢，但序列讀長較短，測序后數據的裝配需要強大生物信息學分析技術的支持。Roche公司的454 GS－FLX平臺雖準確率較低，成本高，但讀長可達400bp，尤其適用于缺乏基因組參考而需要從頭拼接的中草藥等轉錄組研究。

筆者認為，在中草藥大多缺乏可參考的基因組信息的情況下，Roche公司的454 GS－FLX平臺比較適合中草藥的RNA－seq研究。因為，測序讀長越長，越有利于序列的組裝和生物信息學分析，Roche公司的454 GS－FLX平臺可達400bp左右。

目前，應用RNA－seq技術，可以對中草藥進行轉錄本結構及變異、基因表達水平差異、非編碼區域功能、低豐度全新轉錄本發現等研究。RNA－seq已經成功用于水稻、玉米等的大規模EST測序研究，并發現了這些物種更多 EST［6－8］。例如，Logacheva等通過比較甜蕎(F．esculentum)和苦蕎(F．tataricum)的轉錄組測序結果，分析了兩者的差異表達基因，這些差異基因包括逆轉座子基因以及糖類合成與代謝相關基因［9］。

最近，我國學者對少數中草藥的轉錄組研究上也取得了可喜進展［10－12］。

盡管RNA－seq技術的應用前景廣闊，但該技術也面臨一系列挑戰，在海量的序列數據中，如何詮釋和鑒定同源基因，如何確定最佳測序深度，如何針對更復雜的轉錄組來識別RNA亞型的表達變化，如何降低樣本起始量以滿足某些珍貴中草藥轉錄組測序要求，如何提供序列轉錄的方向信息，以及在缺乏基因組信息的情況下，如何對中草藥等非模式生物測序序列進行基因組定位和注釋(目前，只能進行從頭拼裝，并通過同源比對進行測序序列的注釋和分析，因此對后期生物信息學分析方法及軟件有極高的要求)。相信隨著測序方法的不斷進步，使用更長的讀段技術或單分子測序技術有望回答以上問題。

2 lncRNA生物信息學挖掘方法

非編碼RNA是一類不編碼蛋白質但具有多種重要生物學調控功能的RNA分子，可以通過調節mRNA的穩定性及參與RNA的加工和修飾、參與蛋白質的運輸、調控染色體的結構等機制，發揮在胚胎發育、組織分化、器官形成等生物學過程中的調控作用。

近期，非編碼 RNA中的長非編碼 RNA(long non－protein coding RNA，lncRNA)得到了研究人員的廣泛關注。長非編碼RNA是在真核生物中新發現的一類核苷酸，它具有低豐度、類似mRNA結構特征，無長閱讀框架，且長度大于200 bp。基因表達、基因組印記、表觀遺傳調控、X染色體失活、蛋白質折疊等生物學過程，都有其廣泛參與。

lncRNA還可以作為分子伴侶調控蛋白質的構象和作為結構分子錨定蛋白質在細胞內的位置。不僅可以通過結合轉錄因子來激活或抑制靶基因的表達，還能參與組蛋白修飾、mRNA拼接等過程。

雖然lncRNA在各種生物學過程中發揮極其重要的調控作用，而且目前部分lncRNA已得到確定，但對絕大部分lncRNA在生命活動過程中的具體調控機制及功能模式仍不清楚，中草藥轉錄組中lncRNA資源更是急待挖掘。

現階段lncRNA的預測仍依賴生物信息學技術，以挖掘其中lncRNA的序列、結構、表達及功能等信息。使用生物信息學方法對RNA－seq測序結果進行預測，根據預測結果進行RNAi和RIP等lncRNA功能驗證實驗，可以避免功能研究實驗的盲目性，從而節約大量實驗成本。

將測序讀段集合并恢復轉錄組結構的過程被稱作轉錄組重建，轉錄組重建主要分為參考基因組法和基因組獨立法，基因組獨立法更適用于中草藥轉錄組重建，同時需要較高的測序深度。轉錄組重建后通過Cuffcompare等軟件將重建轉錄組與現有基因注釋進行比較，以獲取重建轉錄組的分類，進而利于lncRNA的識別過程。lncRNA識別過程簡要概述如圖1。

圖1 IncRNA識別過程

提取外顯子總長度大于200堿基的轉錄本，此閾值是由lncRNA的定義所決定，本質上是用來區分lncRNA與小ncRNA(如miRNA等)，但從轉錄本中區分mRNA與ncRNA確實是一個繁瑣復雜的過程。對于編碼蛋白質的mRNA來說，其開放閱讀框(ORF)長度一般大于300堿基，若RNA序列的假定ORF長度小于300堿基，則會被判定為ncRNA，但這顯然會導致H19、Xist等假定ORF長度大于300堿基的ncRNA的誤判。應用CPC、CONC、lncRNA等監督機器學習(supervised machine learning)方法，可通過學習肽鏈長度、氨基酸構成、蛋白質同源性、二級結構、蛋白質比對或表達等多種特征，建立分類模型，因而可以減少此類誤判的發生。

近年來，研究人員開發了多種用于lncRNA差異表達分析的軟件。其中，EdgeR、Cuffdiff、DESeq和DEXSeq等方法引入負二項分布(negative bionormial distribution)模型，相比泊松分布能更好地適應生物學偏差。隨著生物信息學的迅猛發展，研究人員也開發了包括catRAPID(Fast predictions of RNA and protein interactions and domains)在內的若干在線分析lncRNA的生物信息學平臺。但是，比較綜合且較完善的涵蓋各物種lncRNA的強大數據庫尚未建立，由于lncRNA屬于低豐度mRNA，需要RNA－seq的測序深度更深，中草藥重要功能lncRNA的挖掘面對極大的挑戰。

當前，lncRNA研究正處于起步階段，面臨著諸多問題亟待解決:

1)lncRNA的定義尚存爭議。一般認為，lncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。但是，有研究者認為，以200個核苷酸作為界定lncRNA過于武斷，因為很多小于200個核苷酸的非編碼RNA既不屬于小RNA(Small RNA)也不屬于結構RNA(Structural RNA)。

2)如何區分功能性和非功能性非編碼轉錄物依然存在困難。

3)由于lncRNA種類和功能的多樣性，致使不同lncRNA研究結果之間的借鑒意義不高。

4)已有lncRNA數據較少，對lncRNA的注釋不夠豐富。

3 結語

盡管RNA－Seq技術還面臨著種種困難，而且，目前對lncRNA的生物學功能和結構特征知之甚少，但是它的發現能力和尋找新的轉錄本的能力從本質上高于芯片技術，相信隨著生物物理技術的不斷進步和測序成本的進一步降低，通過RNA－Seq高通量測序技術對傳統中草藥中lncRNA的序列、結構、表達及功能等信息的挖掘，定會為中草藥的生長、發育、代謝等生物學過程中的分子機制的闡明奠定理論基礎。

［1］ Swarbreck SM，Lindquist EA，Ackerly DD，et al．Analysis of leaf and root transcriptomes of soil－grown Avena barbata plants［J］．Plant Cell Physiol，2011，52(2):317－332．

［2］ 夏天，肖丙秀，郭俊明．長鏈非編碼RNA的作用機制及其研究方法［J］．遺傳，2013，35(3):269－280．

［3］ Marioni JC，Mason CE，Mane SM，et al．RNA－seq:an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays［J］．Genome Res，2008，18(9):1509－1517．

［4］ 祁云霞，劉永斌，榮威恒．轉錄組研究新技術:RNASeq及其應用［J］．遺傳，2011，33(11):1191－1202．

［5］ 李湘龍，柏斌，吳俊，等．第二代測序技術用于水稻和稻瘟菌互作早期轉錄組的分析［J］．遺傳，2012，34(1):102－112．

［6］ Weber APM，Weber KL，Carr K，et al．Sampling the arabidopsis transcriptome with massively parallel pyrosequencing［J］．Plant Physiol，2007，144(1):32－42．

［7］ Logacheva MD，Kasianov AS，Vinogradov DV，et al．De novo sequencing and characterization of floral transcriptome in two species of buckwheat(Fagopyrum)［J］．BMC Genomics，2011，12(1):30．

［8］ Li Y，Sun C，Luo HM，et al．Transcriptome characterization for Salvia miltiorrhiza using 454GS FLX［J］．Acta Pharmaceutica Sin，2010，45(4):524－529．

［9］ Wu Q，Sun C，Luo HM，et al．Transcriptome analysis of Taxus cuspidate needles based on 454 pyrosequencing［J］．Planta Med，2011，77(4):394－400．

［10］ Zhou YJ，Gao F，Liu R，et al．De novo sequencing and analysis of root transcriptome using 454 pyrosequencing to discover putative genes associated with drought tolerance in Ammopiptanthus mongolicus［J］．BMC Genomics，2012，13(1):266．

［11］ Hao DC，Ma P，Mu J，et al．De novo characterization of the root transcriptome of a traditional Chinese medicinal plant Polygonum cuspidatum［J］．Sci China Life Sci，2012，55(5):452－466．

［12］ Lu ZJ，Yip KY，Wang G，et al．Prediction and characterization of noncoding RNAs in C．elegans by integrating conservation，secondary structure，and high－throughput sequencing and array data［J］．Genome Res，2011，21(2):276－285．