RNAi 和GroEL 介導的雙價轉基因番茄對TYLCV的抗性

楊瑪麗， 張保龍， 郭佳茹， 趙統敏， 余文貴， 趙麗萍， 王銀磊

(1.江蘇省農業科學院蔬菜研究所，江蘇 南京210014;2.江蘇省農業科學院農業生物技術研究所，江蘇 南京210014)

番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，是一類具有孿生顆粒形態的植物單鏈DNA 病毒，變異頻率較高［1-6］。由該病毒引起的番茄黃化曲葉病(TYLCD)是目前番茄生產上最為嚴重的病害之一，已在世界上40 多個國家大面積暴發并逐年加重，給當地農民均造成巨大經濟損失［7-12］。該病害暴發突然、擴展迅速、危害性極強，一旦發生化學方法難以防治。另外，對雙生病毒的抗性資源的相對匱乏，抗性遺傳機制不明確等因素，又增加了利用常規育種手段進行植物雙生病毒抗性改良的難度［13］。近年來，隨著番茄基因工程技術的發展，為利用外源基因提高番茄對TYLCV 的抗性提供了一條有效途徑。目前主要是通過轉基因植物表達病毒蛋白(病毒外殼蛋白、復制相關蛋白和運動相關蛋白)［14-16］、RNAi 或反義RNA 技術［17-19］、利用煙粉虱體內的GroEL分子伴侶蛋白［20-21］等策略來實現對雙生病毒的抗性。

然而，利用上述策略提高植物對雙生病毒的抗性均存在一定的局限性。比如，植物表達病毒復制酶基因需要轉基因植株的高表達、復制酶同時對植物的生長和發育的干擾及其抗性機制的不明確都限制了復制酶基因在抗雙生病毒中的實際應用［22-23］。雙生病毒是DNA 病毒，通過RNAi 技術并不能從根本上降解病毒，從而降低了利用RNAi 抗病毒的效果［24］。為了尋找新的有效防治TYLCVD 的策略，本研究根據RNAi 和GroEL基因抗性機制的不同，將實驗室前期利用煙粉虱體內共生菌GroEL基因構建的SUC2-GroEL植物表達載體，及利用TYLCV 的AC1和AC2反向重復序列構建的植物表達載體pBI121-AC1-AC2，通過農桿菌介導的轉化法共轉化番茄，以期得到含單個基因和雙基因的抗病再生植株，為番茄抗TYLCV 改良提供新的種質資源。

1 材料與方

1.1 材料

1.1.1 植物材料及病毒源 有限生長類型番茄CT9210 自交系由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供。含有侵染性克隆PTYj01 的農桿菌EHA105 由江蘇省農業科學院植物保護研究所季英華老師提供。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、根 瘤 農 桿 菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105、質粒pBIl21 均為江蘇省農業科學院農業生物技術研究所提供。TA 克隆載體PMD20-T 載體購自TaKaRa 公司，載體iHp［25］和pBI121 由江蘇省農業科學院農業生物技術研究所提供。

1.1.3 試劑 T4 DNA 連接酶、限制性內切酶(Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、SacⅠ、XhoⅠ)、DNA 分子量標準均購自TaKaRa 公司，其他試劑為國產分析純試劑，組織基因組DNA 提取試劑盒購自TIANGEN 生物公司，質粒提取試劑盒、PCR 清潔試劑盒、DNA 片段快速純化/回收試劑盒購于AXYGEN 公司。

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體圖譜 反向重復序列表達載體pBI121-AC1-AC2及SUC2-GroEL由江蘇省農業科學院農業生物技術研究所提供，構建圖譜見圖1。

圖1 反向重復序列表達載體(A)及標記載體SUC2-GroEL(B)構建圖譜Fig.1 The construction of inverted repeat sequence express vector pBI121-AC1-AC2(A)and plant expression vector SUC2-GroEL(B)

1.2.2 RNAi 表達載體轉化番茄及轉基因植株鑒定

利用農桿菌介導的葉盤轉化法轉化番茄。櫻桃番茄感病自交系CT9210 種子用70%乙醇浸泡30 s，然后用10%次氯酸鈉消毒15 min，期間不斷搖動，隨后用無菌水沖洗3 遍，接種于1/2 MS 培養基上培養10 d;取番茄無菌苗的子葉或下胚軸為外植體，用OD600=0.3 左右的農桿菌菌液浸泡感染外植體5 min。取出外植體，置于無菌干燥濾紙上吸干殘留菌液，轉入MS+IAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培養基上黑暗處共培養48 h，然后轉入MS + IAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L +頭孢霉素500 mg/L +卡那霉素50 mg/L篩選培養基上，25 ℃、18 h(光)/6 h(暗)的光照周期進行培養。每3 周換1 次培養基。約40 d 左右分化出綠色芽點;待再生芽長到3 ～4 cm時切下并轉入1/2MS+IBA 1.0 mg/L+頭孢霉素400 mg/L生根培養基中培養;根系發達后移栽至土壤。

用CTAB 法提取番茄再生植株葉片總DNA，用引物GroELF496/GroELR1058(表1)驗證SUC2-Gro-EL載體，內含子特異引物FAD-intronF/FAD-intronR驗證pBI121-AC1-AC2載體。PCR 擴增程序如下:95℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸50 s，30 個循環;72 ℃延伸5 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

選擇PCR 檢測所得到的陽性轉基因番茄再生植株和對照植株，用Trizol 試劑盒提取植株葉片總RNA。以反轉錄所得到的cDNA 為模板，以引物NPTF/NPTR 驗 證pBI121-AC1-AC2載 體，以Gro-ELF496/ GroELR1058 驗證SUC2-GroEL載體。取10 μl PCR 產物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

表1 引物序列及擴增片段Table 1 Primer sequences and the sizes of amplified fragments

1.2.3 抗性鑒定 采用TYLCV 侵染性克隆農桿菌注射接種法對3 ～4 葉期苗齡的非轉基因和轉基因番茄進行接種，接種時用1 ml 一次性注射器吸取TYLCV 侵染性克隆農桿菌(OD600=0.5 ～0.6)，在距離根部1 ～2 cm 處取3 點進行韌皮部注射，接種植株置于防蟲溫室，在25 ℃、18 h(光)/6 h(暗)的光照周期下培養。提取農桿菌注射接種后30 d 的番茄葉片DNA，用引物AV494/COPR［26］進行PCR檢測，PCR 擴增程序如下:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30 個循環;72 ℃延伸5 min。

2 結果與分析

2.1 轉基因陽性植株的獲得

2.1.1 轉基因植株的再生 在轉化前，對番茄外植體進行卡那霉素臨界濃度測定，結果顯示最佳臨界篩選濃度為90 mg/L。通過農桿菌介導轉化番茄CT9210 子葉和下胚軸外植體，篩選獲得卡那霉素抗性番茄植株(圖2)，總計19 株。

2.1.2 再生番茄植株的PCR 檢測 提取全部再生植株的總DNA，以引物GroELF496/GroELR1058 檢測SUC2-GroEL載體，內含子特異引物FAD-intronF/FAD-intronR 檢測pBI121-AC1-AC2載體，以非轉基因番茄植株DNA 為對照。電泳檢測結果顯示:利用GroEL基因引物擴增，有11 株番茄再生植株能擴增出562 bp 的目的條帶(圖3A)，利用RNAi 載體的FAD 引物擴增，有9 株能擴增出約800 bp 的目的條帶(圖3B)，非轉基因植株用兩對引物均沒有擴增到特異條帶，初步推斷GroEL外源基因和AC1、AC2的反向重復序列已經導入番茄基因組中，其中轉SUC2-GroEL載體的有2、3、6、9、11、14、15、17 號植株，轉pBI121-AC1-AC2載體的有1、4、5、8、10、13 號植株，轉SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2雙載體的有3 株(7、12、19 號植株)。

2.1.3 轉基因番茄植株的RT-PCR 檢測 以引物GroELF496/GroELR1058、NPTF/NPTR 分別對PCR 檢測呈陽性的轉基因植株做RT-PCR 檢測，結果顯示:11 株轉SUC2-GroEL載體的陽性苗中，有7 株能擴增出562 bp 的目的條帶(圖4A);9 株轉pBI121-AC1-AC2載體陽性苗中有5 株能擴出約600 bp 的目的條帶(圖4B)，轉SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2雙載體的有2 株(7、12 號)。說明GroEL外源基因與AC1和AC2的反向重復序列成功在轉錄水平表達。其中轉SUC2-GroEL載體的有5 株(2、6、9、14、17 號)，轉pBI121-AC1-AC2載體的有3 株(4、10、13 號)。

圖2 番茄的遺傳轉化Fig.2 Genetic transformation of tomato

圖3 再生植株［SUC2-GroEL 載體(A)和pBI121-AC1-AC2 載體(B)］的PCR 檢測結果Fig.3 The amplification of regenerated tomato plants via SUC2-GroEL vector (A)and pBI121-AC1-AC2 vector (B)by PCR

圖4 再生陽性植株［SUC2-GroEL 載體(A)和pBI121-AC1-AC2 載體(B)］的RT-PCR 檢測Fig.4 The amplification of transgenic tomato plants via SUC2-GroELvector (A)and pBI121-AC1-AC2 vector (B)by RT-PCR

2.2 轉基因植株抗病性鑒定

2.2.1 T0代轉基因植株抗病性鑒定 提取接種病毒后30 d 的非轉基因番茄植株和在轉錄水平表達的單/雙價轉基因番茄植株葉片的總DNA，用TYLCV 病毒特異引物AV494/COPR 做PCR 檢測。結果如圖5 所示，接種病毒后的非轉基因植株能擴增出570 bp 的病毒條帶，轉基因植株中有3 株擴出微弱條帶，7 株未擴出條帶。其中轉SUC2-GroEL載體的植株中，2 號和14 號擴出570 bp 的病毒條帶，而6、9、17 號未擴出570 bp 的病毒條帶;轉pBI121-AC1-AC2基因的植株中，10 號擴出570 bp 的病毒條帶，4號和13 號未擴出570 bp 的病毒條帶;轉SUC2-Gro-EL/ pBI121-AC1-AC2雙價載體的7 號和12 號植株均未擴增出570 bp 的病毒條帶。發病情況調查結果，非轉基因番茄植株在接種20 d 時開始表現癥狀，接種30 d 新葉邊緣黃化、卷曲，葉片皺縮，植株嚴重矮化，發病癥狀嚴重;轉基因番茄植株中檢測到病毒條帶的2、14 號植株，接種20 d 時有輕微癥狀，接種30 d 時的葉片邊緣黃化，卷曲，植株輕度矮化;而檢測到病毒條帶的10 號植株在接種20 d 時沒有任何癥狀，接種30 d 時葉片表現輕微黃化，卷曲不明顯;未檢測到病毒條帶的轉基因番茄植株(4、6、7、9、12、13、17 號)均生長正常，未表現發病癥狀。

圖5 轉基因番茄植株病毒引物PCR 分析Fig.5 The analysis of transgenic tomato plants by PCR with virus primers

2.2.2 T1代轉基因番茄的抗病性鑒定 轉SUC2-GroEL、pBI121-AC1-AC2、SUC2-GroEL/ pBI121-AC1-AC2不同載體的3 類轉基因番茄中，每類選取2 個T0代未擴出病毒條帶株系，每個株系隨機挑選10株陽性植株進行接種。30 d 后對這些植株提DNA檢測病毒含量并統計發病情況，結果顯示:在T1代非轉基因植株能擴增到570 bp 的病毒條帶(圖6);轉SUC2-GroELT0代未擴出病毒條帶的2 個株系20個植株中有7 株擴出病毒條帶，帶毒率35%;轉pBI121-AC1-AC2T0代未擴出病毒條帶的2 個株系20 個植株中有5 株擴出病毒條帶，帶毒率25%;轉SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2T0代未擴出病毒條帶的2 個株系20 個植株中有3 株擴出病毒條帶，帶毒率是15%(表2)。

圖6 部分轉基因番茄植株(T1 代)病毒引物的PCR 分析Fig.6 The analysis of some transgenic tomato plants by PCR with virus primers

表2 T1 代轉基因番茄TYLCV 侵染性克隆農桿菌注射30 d 后病毒檢測結果Table 2 Detection of TYLCV in T1 transgenic tomato 30 d after injection of infections clone

發病情況調查結果發現，接種30 d 后，非轉基因植株已明顯矮化，葉片邊緣黃化、卷曲、皺縮;擴出病毒條帶的轉基因植株中部分植株的新葉有輕微卷曲，部分植株不表現病癥;未擴出病毒條帶的轉基因植株均表型正常，表現一定的抗性。

3 討論

通過轉基因技術將外源基因導入植物體內，能夠提高植株的抗病能力，但是在高選擇壓下或病毒發生變異的情況下，只將單個基因導入植物獲得的抗病性還不能達到滿意的效果，而將多個與抗病相關的基因轉入到同一個植物中可能會提高轉基因植物的抗病毒能力。GroEL基因是煙粉虱體內共生菌編碼的基因，通過在轉基因植物韌皮部特異表達GroEL 蛋白，使病毒粒子被包裹在GroEL 蛋白中，抑制病毒的復制和移動，從而達到轉基因番茄對TYLCV 的抗性［20］。我們前期研究中構建SUC2-GroEL載體并轉化番茄，同樣證實了利用基因GroEL提高番茄黃化曲葉病毒抗性具有可行性［21］。RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是動植物抗病毒的一種防衛機制，正在被應用于作物遺傳改良和抗病毒分子育種。利用RNAi 抗病毒可通過轉基因植物表達病毒dsRNA 來實現，當出現dsRNA 時，核糖核酸酶III 家族中特異識別雙鏈RNA 的dicer酶切割dsRNA，并將RNA 降解為21 ～25 bp 的雙鏈小分子干擾RNA［27］。本研究前期研究中采集番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)毒源，利用重疊PCR 技術獲得TYLCV 的AC1-AC2融合基因片段，構建了RNAi 植物表達載體，同時沉默了TYLCV 的2 個目標基因。本研究根據GroEL基因和RNAi 抗性機制的不同，將構建的SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2兩個載體進行共轉化，成功獲得了含單基因和雙基因的抗病再生植株，為番茄抗TYLCV 改良提供新的種質資源。本研究中對T1代轉基因植株進行TYLCV 侵染性克隆農桿菌注射接種鑒定，發現轉SUC2-GroELT0代未擴出病毒條帶的2 個株系植株平均帶毒率35%，轉pBI121-AC1-AC2T0代未擴出病毒條帶的2 個株系植株帶毒率25%，轉SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2T0代未擴出病毒條帶的2 個株系植株帶毒率15%，可見，相比轉單個基因的植株，轉雙基因的番茄植株中抗病單株的比例更高，發病單株的癥狀明顯較輕，而利用引物AV494/COPR 進行病毒檢測時擴出的病毒條帶也較弱，因此初步推斷轉雙基因的植株抗病能力要優于轉單基因植株抗病能力。在今后工作中，將進一步利用T2代同時含有RNAi和GroEL的轉基因植株進行TYLCV 接種，研究其抗性的遺傳穩定性。

番茄黃化曲葉病自近年在我國廣東、浙江、江蘇等地發生以來，自南向北迅速蔓延至我國大部分地區，而不同地區的病毒變異較大［28-32］，因此，有必要利用各地區相應病毒(番茄黃化曲葉病毒、番木瓜曲葉病毒、中國番茄黃化曲葉病毒、煙草曲葉病毒等)的侵染性克隆接種鑒定，對本研究所得轉基因材料的抗性進行系統研究，確定其是否具備廣譜抗性。

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