缺血性糖尿病潰瘍模型探討*

彭旦明 盧仁軍 趙詩云 張瑾楠

（1江西省中醫藥研究院 南昌330046；2江西中醫藥大學2012級碩士研究生 南昌330004）

糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神經病變及各種不同程度末梢血管病變而導致下肢感染、潰瘍形成或深部組織的破壞[1～2]，糖尿病嚴重的患者可能截肢，給病人帶來沉重的生理和心理負擔。近年來糖尿病足發病率明顯增加，但關于糖尿病足的發病機理仍不清楚，合適的糖尿病足模型的建立顯得十分重要。缺血-再灌注損傷是導致糖尿病潰瘍發生的重要原因之一[3]，鏈脲佐菌素（STZ）的劑量對動物血糖及維持時間影響重大，可直接影響潰瘍的形成與愈合時間。本實驗擬通過觀察不同劑量STZ對糖尿病足大鼠模型的影響，尋求最佳劑量，建立合適的糖尿病大鼠潰瘍模型。現報告如下：

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠（購自湖南斯萊克景達動物有限公司，動物許可證號：SCXK[湘]2011-0003）70 只，體重 180～200 g，SPF 級。動物飼料由湖南斯萊克景達動物有限公司生產，許可證號：SCXK（湘）2014-0002。動物飼養環境：室溫 20～25℃，濕度40%～70%，單籠喂養，自由攝食、飲水。

1.2 實驗試劑和儀器 鏈脲佐菌素（上海源聚生物科技有限公司）；檸檬酸，檸檬酸三鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；戊巴比妥鈉（西亞試劑有限公司）；碘伏消毒液，95%乙醇消毒液（江西草珊瑚消毒用品有限公司）。

1.3 儀器 羅氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖儀，血糖測試紙（德國Roche公司產品）；超凈工作臺（蘇州馮氏實驗動物設備有限公司）；Olympus光學顯微鏡（上海天放實驗儀器有限公司）；磁通量1 500高斯圓片形磁鐵（直徑13 mm、厚度2 mm，由深圳明鑫科技有限公司提供，所有磁鐵使用前均高壓滅菌消毒）。

1.4 糖尿病大鼠潰瘍模型制備 將SD雄性大鼠70只隨機分為7組，每組10只，空白對照組及6個劑量 STZ 組 ， 劑 量分 別為 30、40、45、50、55、60 mg/kg，背部剃毛消毒。以3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg劑量腹腔注射，麻醉后在大鼠背部脊柱一側做一深至筋膜的切口，鈍性分離，將磁片植入皮下，切口縫合后消毒，手術后的大鼠單籠飼養。4 d后創口完全愈合，第5天禁食12 h，按照上述劑量腹腔注射1%的STZ（STZ使用前用0.1 mol/L、pH=4.5的檸檬酸緩沖液調配），分別在注射STZ前及注射1 d、3 d、7 d、10 d、14 d 測各組動物空腹血糖值、體重、飲水量及進食量。注射STZ第10天（大鼠糖尿病成模），在埋植磁鐵處接外源磁片，外接磁鐵與體內植入的磁鐵相互吸引產生壓力，造成局部皮膚缺血，每次磁鐵壓迫時間為2 h、2 h、1 h，中間將磁鐵拿下，讓組織血流恢復30 min，如此為一個循環，每天3個循環，連續4 d。觀察大鼠潰瘍的形成與變化，第15天（壓迫結束后）取潰瘍周邊皮膚組織10%甲醛固定，常規石蠟包埋切片（4 μm），HE 染色，光學顯微鏡下觀察創面組織病理狀況。

1.5 統計學分析 用SPSS11.0軟件處理數據，結果以均數±標準差（±S）表示，方差齊用t檢驗，方差不齊用Cochran&Cox近似t檢驗。P＜0.05表示實驗結果具有顯著性差異，P＜0.01表示結果具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態觀察 磁片植入皮下切口縫合后，約4 d時間動物傷口可完全愈合，對照組及30 mg/kg STZ給藥組動物活動、進食量、飲水量及血糖量未見明顯異常，而40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、55 mg/kg、60 mg/kg STZ 給藥組動物隨著劑量的增加，動物活動明顯減弱，體形消瘦，毛發干枯、豎立，飲水量及尿量明顯增多，STZ劑量為60 mg/kg實驗組大鼠體重下降過快，部分動物出現死亡。在埋植磁鐵處接外源磁片后，連續4 d每天3個循環壓迫，對照組及STZ給藥組均形成了潰瘍。

2.2 皮膚組織病理學檢查 光學顯微鏡下觀察對照組大鼠皮膚切片顯示：表皮角質清晰，復層排列存在，毛囊結構正常，真皮膠原豐富，表皮與真皮厚度正常。STZ給藥組大鼠表皮真皮組織復層排列消失，組織出血滲血、壞死出現空泡，炎性細胞大量聚集等特征。

2.3 各組大鼠血糖值的變化 結果顯示：腹腔注射STZ后，對照組及30 mg/kg STZ給藥組動物血糖值在14 d內未見明顯變化，各組動物給藥1 d（24 h）后與給藥前相比也未見明顯變化，給藥3 d（72 h）后 ，50、55、60 mg/kg 劑 量 組 血 糖 值 大 于 16.7 mmol/L，其余各劑量組動物血糖值均明顯增高，但不到16.7 mmol/L。在給藥7 d后，除了30 mg/kg組外，其余STZ給藥組動物血糖值均大于16.7 mmol/L（血糖儀最大測定值為33.3 mmol/L，超值后按33.3 mmol/L計）。見表1。

表1 實驗大鼠血糖值的變化 （±S） mmol/L

表1 實驗大鼠血糖值的變化 （±S） mmol/L

注：經 t檢驗：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 40 mg/kg 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 給藥前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d對照組30 mg/kg 40 mg/kg 45 mg/kg 50 mg/kg 55 mg/kg 60 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 4.6±0.5 4.3±0.8 4.9±0.4 4.8±0.7 4.9±0.4 4.5±0.6 4.7±0.3 4.7±0.6 4.9±0.8 5.5±0.7 5.2±0.9 5.3±0.1*5.7±0.4*5.9±0.7*4.4±0.6 5.0±0.9 9.5±1.2*10.7±2.0*18.4±2.4**#19.0±2.2**#21.4±3.2**##4.7±0.6 4.3±0.7 21.6±2.3**21.3±3.2**26.9±2.1**#27.4±3.6**#30.4±1.5**##4.4±0.6 5.1±0.3 29.5±2.4**30.9±1.7**31.2±0.4**30.2±1.5**32.7±0.2**5.4±0.4 5.2±0.8 30.7±1.5**29.5±2.2**31.0±0.9**31.1±0.7*32.8±0.3**

2.4 各組大鼠體重的變化 結果表明：給藥前各組大鼠體重無明顯差異，P＞0.05。給藥后除 30 mg/kg STZ給藥組外，其余各組大鼠體重明顯下降，與正常對照組相比有顯著性差異，P＜0.05。在自由攝食、進水的狀態下，正常對照組大鼠體重隨著時間的推移體重不斷增加，而同樣在自由攝食、進水的狀態下，糖尿病足組大鼠隨著時間的推移體重逐漸下降，其中60 mg/kg STZ給藥組大鼠體重下降幅度過快，當體重下降幅度達到50 g左右時，出現死亡，10只大鼠實驗期間死亡5只。見表2。

表2 實驗大鼠體重的變化 （±S） g

表2 實驗大鼠體重的變化 （±S） g

注：經 t檢驗：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 40 mg/kg 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 給藥前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d對照組30 mg/kg 40 mg/kg 45 mg/kg 50 mg/kg 55 mg/kg 60 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 190.3±16.8 188.2±24.7 186.9±14.0 194.5±16.6 193.1±20.8 191.9±15.3 191.2±20.9 190.5±27.9 190.1±18.9 186.2±14.1 195.1±17.5 186.7±16.2 191.3±11.6 190.3±18.7 194.7±26.7 193.0±23.8 182.9±13.4 190.3±15.9 179.7±19.6*177.9±17.5*175.3±20.5*#200.2±18.6 202.1±25.1 175.7±19.9*178.2±15.4*178.3±27.4*176.8±19.8**162.3±16.7**#205.3±13.7 210.7±26.8 171.7±11.6**176.3±10.5**171.2±21.3**165.9±10.5**155.6±14.8**##210.7±20.4 217.3±17.9 166.4±14.5**170.3±19.6**165.6±15.8**160.9±22.4**150.8±15.8**#

2.5 各組大鼠飲水量的變化 結果表明：實驗初各組大鼠飲水量并無統計學差異，給藥后1 d后，除30 mg/kg給藥組大鼠外，其余劑量組大鼠飲水量均明顯增多（P＜0.05），第3天后大鼠飲水量較正常組增加數倍。見表3。

表3 實驗大鼠飲水量的變化 （±S） mL

表3 實驗大鼠飲水量的變化 （±S） mL

注：經 t檢驗：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 40 mg/kg 組比較，#P＜0.05。

組別 n 給藥前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d對照組30 mg/kg 40 mg/kg 45 mg/kg 50 mg/kg 55 mg/kg 60 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 19.3±1.9 20.2±2.6 17.8±2.3 20.2±3.6 21.4±1.8 17.9±2.1 21.7±2.3 19.6±2.5 21.1±2.9 30.6±4.5*33.3±4.4*38.1±5.9*46.1±4.6*#50.4±4.8*#20.4±2.1 20.8±2.6 82.0±7.9**79.6±10.1**107.7±9.4**#112.5±11.4**#120.6±14.4**#20.8±2.8 21.3±3.5 122.6±19.4**127.5±18.1**113.8±15.7**132.7±15.1**140.6±15.1**#18.8±2.2 22.8±3.5 155.4±10.8**158.5±12.8**155.7±14.5**#163.0±13.1**#170.1±16.7**#22.4±3.2 20.4±2.4 160.5±20.2**165.3±21.7**170.5±17.8**#169.8±18.9**#174.1±20.5**#

2.6 各組大鼠進食量的變化 結果表明：各組大鼠均自由進食，給藥前各組進食量無明顯差異，P＞0.05。給藥3 d后，50～60 mg/kg給藥組大鼠進食量明顯增多；第7～14天，給藥組大鼠除30 mg/kg外，與對照組比其余劑量組大鼠進食量明顯增多，P＜0.05。見表4。

表4 實驗大鼠進食量的變化 （±S） g

表4 實驗大鼠進食量的變化 （±S） g

注：經 t檢驗：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 40 mg/kg 組比較，#P＜0.05。

組別 n 給藥前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d對照組30 mg/kg 40 mg/kg 45 mg/kg 50 mg/kg 55 mg/kg 60 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 18.3±1.9 19.9±1.3 20.0±2.1 19.6±2.7 19.7±1.6 19.3±2.1 18.4±1.9 19.9±2.6 20.4±2.2 22.1±2.6 20.3±2.6 21.8±1.8 21.3±1.8 20.1±1.7 21.2±2.5 19.9±2.1 23.2±2.5 21.2±2.7 27.8±2.7*#26.2±2.1*#27.4±2.5*#18.2±1.5 21.5±3.6 29.1±4.5*30.7±5.2*35.7±2.7**#35.7±3.6**#40.6±4.5**#20.1±3.7 22.6±1.8 37.5±2.5**35.9±5.4**36.3±3.8**37.9±2.9**39.8±5.4**18.9±2.4 20.7±2.1 40.8±5.3**42.3±4.4**39.1±3.8**40.9±5.7**41.9±4.8**

3 討論

約15%的糖尿病患者最終都會出現糖尿病足潰瘍，糖尿病潰瘍難以愈合，且治愈后容易復發，是導致糖尿病患者截肢的主要原因，其致殘率很高。普遍認為主要是大、小及微血管病變，周圍神經受損及各種損傷所致，血糖升高、組織缺血是造成糖尿病足的重要因素[4]。

合適的糖尿病潰瘍動物模型對糖尿病足的研究十分重要。STZ可選擇性地作用于胰島β細胞，通過釋放NO和氧自由基，使胰島β細胞遭到破壞，從而使胰島素分泌減少。STZ給藥劑量對動物整體生命體征、血糖值及維持時間影響重大，可直接影響潰瘍形成和變化。然而文獻報道STZ給藥劑量從25～60 mg/kg 不等[5～6]均可引起糖尿病，我們在前期研究中發現當STZ給藥劑量為30 mg/kg時，血糖無明顯升高，而達到60 mg/kg時，2周內會出現多數動物死亡，為了建立合適的模型有必要考察STZ的最佳給藥劑量。

當前糖尿病足動物模型的制備主要以化學藥物誘導為主，配合外部干預。糖尿病足動物模型主要有單純化學藥物造模、化學藥物結合溫度控制造模或者配合外科手術、化學藥物配合磁片循環壓迫法四種[7]。其中葛良鵬等[8]采用磁片循環壓迫的方法，很好地實現了缺血與復流相交替的過程，可以很好地模擬臨床潰瘍；且實驗動物具有臨床糖尿病足患者的發病特點：“多飲、多食、多尿、體重減輕”這“三多一少”的臨床癥狀；誘導出的糖尿病足潰瘍模型具有組織壞死、炎性細胞大量聚集等特征，其病理改變與人十分相似，且動物存活率高，是一種較好的糖尿病潰瘍模型。

本實驗選擇的是磁通量為1 500高斯的磁鐵，磁通量的選擇是根據誘導潰瘍的流體靜力壓計算而得。有研究表明，當外加壓力超過局部毛細血管壓力12～32 mmHg時，可誘導出潰瘍，外加壓力為50 mmHg左右時最合適[9]。本實驗結果表明，腹腔注射40～60 mg/kg STZ后的大鼠均可造成糖尿病模型，但是40 mg/kg、45 mg/kg在7 d后血糖值才會高于16.7 mmol/L，50～60 mg/kg 在 3 d 后血糖值可高于16.7 mmol/L，但60 mg/kg劑量對大鼠損害過大，易造成大鼠死亡，因此認為造成糖尿病潰瘍動物模型STZ的合適劑量為50～55 mg/kg。

[1]楊立蕓.糖尿病足發病機制、分級及治療[J].社區醫學雜志，2013，11(15)：11-13

[2]肖正華.糖尿病足潰瘍發病機制及診治的臨床進展[J].實用醫學雜志，2012，28(16)：2 661-2 663

[3]Loots MA，Lamme EN，Zeegelaar J，et al.Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds[J].J Invest Dermatol，1998，111(5)：850-857

[4]張瑩.糖尿病足內皮功能紊亂機制的研究進展[J].檢驗醫學，2013，28(10)：948-951

[5]陳群力，楊五彪，馬靈筠.實驗性糖尿病足大鼠模型的建立[J].河南預防醫學雜志，2004，l5(1)：1-2

[6]陳群力，馬靈筠，楊五彪，等.糖尿病性肢端壞疽大鼠模型的建立及實驗研究[J].實用診斷與治療雜志，2003，17(6)：457-459

[7]相勝敏，王健.糖尿病足動物模型及其特點[J].中國中西醫結合外科雜志，2007，13(3)：306-308

[8]葛良鵬，魏泓.大鼠糖尿病潰瘍動物模型的初步研究[J].中國實驗動物學報，2005，13(2)：88-90

[9]Peirce SM，Skalak TC，Rodeheaver GT.Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation：A skin model in the rat[J].Wound Repair Regen，2000，8(1)：68-76