應用生物酸化浸米技術生產黃酒

謝廣發 ， 曹 鈺 ， 程 斐 ， 王哲迪 ， 陸 健

（1.中國紹興黃酒集團有限公司 國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興312000；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；4.江南大學 糧食發酵工藝及技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122）

黃酒是我國傳統發酵產品的典型代表，具有6 000多年的釀造歷史，享有“國酒”的美譽[1]。浸米是黃酒釀造中的重要環節，其目的不僅使原料大米充分吸水膨脹便于蒸煮，更是為了使米酸化，以調節發酵醪液的酸度，保障發酵的安全進行。浸米過程所需的時間較長，傳統黃酒釀造在冬季浸米長達16～20 d，在機械化黃酒生產工藝中也需要保溫浸米4～5 d[2]。生產中有時浸米會產生不良氣味，糯米浸漬后經常出現粘糊和破碎現象，這種米在蒸飯機蒸飯時會出現大量結塊和生心，不但降低出酒率，而且由于細菌能利用生淀粉，往往導致黃酒酸敗，嚴重影響產品質量，給企業帶來巨大的損失。

目前對于黃酒生產中浸米環節的研究遠遠少于其他釀造環節，主要集中于米漿水中微生物的認識，浸米控制經驗的總結以及不同品種米浸米特性的研究[3-6]。為改善黃酒浸米環節的品質，作者研究了接種優良乳酸菌的生物酸化浸米技術。前期已篩選獲得一株適用于黃酒浸米的乳酸菌Lactobacillus plantarum CGMCC7184，能有效縮短浸米時間，穩定浸米質量。作者進一步將生物酸化浸米技術應用到黃酒釀造生產中，分析其在浸米環節的效果，并評估該技術對黃酒釀造過程和成品的影響，探討生物酸化浸米的現實生產成效。

1 材料與方法

1.1 菌株

Lactobacillus plantarum CGMCC7184：作者所在實驗室分離篩選鑒定[7]，為保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的專利菌株。

1.2 原料

生產用糯米：由古越龍山酒廠提供。

1.3 方法

1.3.1 生物酸化浸米方法 米水同時投入浸米罐中，每罐投料 10 t米，料水比 1∶1.25，浸米溫度 25℃，接種體積分數0.2%L.plantarum種子液。以自然浸米為對照。

1.3.2 黃酒釀造 黃酒釀造按照古越龍山機械化黃酒釀造工藝進行。

1.3.3 常規指標測定 總糖、總酸、酒精度、氨基態氮、非糖固形物、氧化鈣、pH值等參照GB/T 13662-2008測定。

1.3.4 有機酸HPLC色譜測定條件 高效液相色譜儀 Agilent1100 （Perkin Elmer Series 200），IC PAKTMION Exclusion（WAT010290）色譜柱及 IC PAKTMION Exclusion Insert保護柱芯；柱溫50℃；流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液；流速0.5 mL/min；二極管陣列檢測器，檢測波長210 nm[8]。

1.3.5 生物胺樣品處理和測定方法 見文獻[9]。

1.3.6 米淀粉糊化特性DSC分析 將大米磨碎，過60目篩。取3 mg左右樣品于坩堝內，加3倍體積的水，密封過夜。掃描區間為20～100℃，降溫速率為l0℃/min。

1.3.7 淀粉質量分數測定 參照GB/T 5009.9-2008。

1.3.8 碎米率的測定 參照GB/T 5503-2009。

1.3.9 黃酒品評 將酒樣密碼編號，置于水浴中，調溫20～25℃。將潔凈、干燥的品酒杯對應酒樣編號，對號注入酒樣24 mL左右。

外觀評價：將注入酒樣的品酒杯置于明亮處，舉杯齊眉，觀察酒樣，做好記錄。香氣評價：手握杯住，慢慢講酒杯置于鼻孔下方，嗅其揮發性香，慢慢搖動酒杯，嗅聞香氣。用手握酒杯腹部2 min，搖動，再嗅其香氣。口味評價：飲入少量酒樣于口中，盡量均勻分布與味覺區，仔細評價口感，有了明確感覺后咽下，回味口感和后味。依據外觀、香氣、口味的特征，綜合評價酒樣的風格及典型性程度，給出分數。

2 結果與分析

2.1 生物酸化技術對浸米過程的影響

車間投料量為糯米10 t/罐，料水比為1∶1.25，浸米室溫度暖氣控制恒溫25℃。生物酸化浸米接種體積分數0.2%L.plantarum，浸米時間為3 d，自然浸米不添加乳酸菌，浸米時間為4 d。

2.1.1 米漿水感官狀態 分別觀察自然浸米和生物酸化浸米的米漿水，自然浸米中各罐米漿水差異較大，有的比較濃稠，而且有的出現了“白花”狀物質，顯微鏡下觀察“白花”為絲狀真菌，見圖1。生物酸化浸米的各罐米漿水品質比較均一，為乳白色漿水，無泡沫和“白花”出現。聞米漿水的氣味，自然浸米的米漿水氣味不宜，且各罐差異性較大，有時會有臭味。而生物酸化浸米的米漿水，只有酸漿味道，氣味宜人。

圖1 自然浸米漿水表面“白花”顯微鏡下形態Fig.1 Microscopic morphology of “white flower” on the seriflux after soaking

2.1.2 米漿水常規指標的分析 測量生物酸化浸米和自然浸米米漿水的pH值，總酸以及漿水固形物的質量濃度，結果見表1。從表1可以看出，生物酸化浸米漿水的pH值均低于自然浸米漿水，酸度則相反，雖然各罐酸度存在差異，但是總體可以看出，生物酸化浸米漿水的酸度高于自然浸米，同時接種浸米的各罐的酸度和pH變化較小，而自然浸米各罐的酸度和pH差異較大，穩定性差。分析認為，生物酸化浸米罐內接種的L.plantarum為優勢菌株，其代謝產乳酸占主導，促使不同接種浸米罐內漿水的總酸基本一致。而在規模生產中，原料來源的差異和場地環境的影響使得自然浸米罐內的微生物種類較為復雜，造成漿水酸度差異大。

表1 米漿水的指標分析Table 1 Analysis of seriflux

從表1漿水固形物質量濃度數據可以看出，接種浸米和自然浸米時漿水中固形物質量濃度差異不大，漿水中固形物質量濃度受浸米方式的影響不大。

2.1.3 米漿水中的有機酸質量濃度 測量米漿水中有機酸質量濃度，結果見表2。米漿水中最主要的酸是乳酸，此外還含有其他的有機酸，如乙酸。從表2可以看出，使用生物酸化浸米技術，米漿水中乳酸的質量濃度明顯提高，甚至達到80%以上，明顯高于自然浸米，并且乙酸的質量濃度有明顯的降低。由于乳酸的氣味口感溫和，并且是乳酸乙酯等風味物質的前體，因而乳酸質量濃度的提高，可能對于釀造的黃酒口感和風味有好處。

表2 米漿水中乳酸和乙酸的質量濃度Table 2 Content of lactic acid and acetic acid in seriflux

2.1.4 米漿水中的生物胺質量濃度 生物胺是生物體內產生的一類低相對分子質量含氮有機化合物的總稱，過量外源生物胺的攝入會引起血管、動脈和微血管的擴大，導致生物體的不良反應。在釀造酒生產過程中，乳酸菌分泌的氨基酸脫羧酶作用于氨基酸會產生生物胺[10]。本研究生物酸化浸米技術中使用的L.plantarum CGMCC7184既無氨基酸脫羧酶活性，又能產生抑菌物質，理論上能有效控制生物胺的形成[11-12]。分析自然浸米和生物酸化技術浸米的米漿水中生物胺質量濃度，結果見表3。

表3 米漿水中生物胺質量濃度Table 3 Content of AB in seriflux

自然浸米的米漿水中生物胺質量濃度明顯高于生物酸化浸米的米漿水中的生物胺質量濃度，且自然浸米各罐米漿水生物胺質量濃度和種類波動很大。分析認為是由于原料和環境中微生物種類和數量存在差異，不同微生物在浸米過程中發揮作用，導致生物胺質量濃度的差異。而生物酸化浸米中接入的L.plantarum為不產生物胺菌株，且能產抑菌物質，能在浸米過程總起主導作用。但由于0.2%的接種體積分數在10 t投料規模下難以做到很好的均勻接種，造成局部的雜菌抑制效果不佳，導致其中存在的生物胺產生菌生長代謝形成不同種類和數量的生物胺。

目前工業生產中雖然漿水不添加到發酵醪中，但考慮到生物胺的溶解性和熱穩定性，在浸漬米中含有的生物胺會帶來發酵產品的安全隱患。表3顯示，接種L.plantarum的生物酸化浸米能有效的降低米漿水中生物胺質量濃度，對釀造安全性有積極意義。

2.1.5 浸漬米指標分析 測定浸泡后糯米的碎米率和淀粉質量分數，結果見表4。

表4 浸漬米的指標分析Table 4 Aalysis of soaked rice

從生物酸化浸漬米的淀粉質量分數高于自然浸漬米，可能與自然浸米時間較長且米漿水中菌種更復雜有關。浸漬糯米中淀粉質量分數的提高，能促使酵母形成更多的乙醇，提高出酒率。生物酸化浸漬米的碎米率明顯低于自然浸米，碎米的多少會影響蒸飯過程，碎米多，不利于蒸汽的擴散，容易造成夾生飯。碎米率的降低對于黃酒的釀造過程也是有益的。

2.1.6 浸漬米淀粉的DSC分析 大米經過浸泡自然發酵后，淀粉的結構特性會發生變化[13]。圖2為原料米、自然浸漬米和生物酸化浸漬米樣品的淀粉DSC糊化溫度曲線。表5為從圖2的DSC曲線計算得出的糊化溫度與吸熱焓值。

圖2 不同處理的米樣淀粉DSC糊化曲線Fig.2 DSC curves of different treated starehes

從表5可以看出，經過浸漬后糯米糊化所需要的熱焓明顯降低，而經過生物酸化浸米后淀粉糊化所需要的焓值又比自然浸漬米降低8%，這表明經過生物酸化浸米后糯米糊化所需要的熱量明顯減少，有利于節省蒸飯能耗。

表5 浸漬米淀粉DSC糊化特性Table 5 DSC measurements results of soaked rice starch

綜上所述，生物酸化浸米不僅能起到縮短浸米時間，改善米漿水的品質，消除浸米環節的不良氣味，提高米漿水中乳酸的質量濃度，降低漿水中生物胺質量濃度，還能降低原料米的淀粉損失率和碎米率，降低了米淀粉的糊化焓值。表明生物酸化浸米對于穩定浸米品質、提高食品的安全性有積極的作用。

2.2 生物酸化浸米技術對黃酒釀造過程的影響

分別采用生物酸化米和常規自然浸漬米，按照古越龍山酒廠機械化生產工藝和控制條件進行黃酒大罐釀造，跟蹤發酵過程中糖酒酸的變化。

從圖3可以看出，總糖曲線在發酵剛開始階段下降很快，后漸漸趨于平緩，前酵階段發酵溫度較高，酵母等微生物迅速繁殖消耗糖分，4 d后緩慢下降，進入后酵，發酵溫度降低，酵母生長緩慢，糖分被消耗殆盡，營養物質逐漸匱乏。生物酸化米在發酵起始時總糖質量濃度比自然浸漬米高，結合表4數據可知，生物酸化浸米淀粉質量分數高因而損失少，且碎米率的降低有利于蒸飯過程的順利進行，利于糖化過程的進行，可能導致了起始階段使用生物酸化米的發酵罐總糖質量濃度較高。

圖3 黃酒發酵過程中總糖變化曲線Fig.3 Curves of total sugar during fermentation process

從圖4可以看出，酒精在發酵開始階段上升迅速，前酵階段溫度較高，營養充分適合酵母生長，并迅速產生酒精。進入后酵后，一方面溫度降低，另一方面營養成分減少造成發酵逐漸減緩，酒精度的增長慢慢趨于平緩。發酵結束后生物酸化米發酵罐酒精度較高，可能與可利用糖分質量濃度較高有關。

圖4 黃酒發酵過程中酒精度變化曲線Fig.4 Curves of alcoholic during fermentation process

從圖5可以看出，酸度在發酵過程中基本呈平穩上升趨勢。生物酸化米在發酵起始時酸度高于自然浸米，但在整個發酵過程中升酸更緩慢平穩。在使用生物酸化浸米技術中，浸米結束時，米漿水的總酸較高，是導致發酵起始時酸度較高的原因。發酵起始較高的酸度有利于抑制其他雜菌的生長。發酵結束時，使用生物酸化浸米的罐酸度正常。

圖5 黃酒發酵過程中總酸變化曲線Fig.5 Curves of total acid during fermentation process

2.3 黃酒理化指標分析

對釀造結束的發酵醪液使用板框壓濾機壓濾，使醪糟和酒液分離，取生清酒檢測理化指標，成品酒由國家級評酒委員進行品評打分，結果見表6。

表6 工廠釀酒試驗理化指標分析Table6 Analysisofwinebrewingin large-scaled manufacture

從表6理化指標看，在工廠大生產釀造中，采用生物酸化浸米工藝釀造的黃酒和自然浸米釀制的黃酒各項理化指標均符合國家標準，其中生物酸化浸米釀造的黃酒總糖質量濃度低于自然浸米釀造的黃酒，而酒精度則稍高于自然浸米釀造的黃酒，這一結果與釀造過程中的變化一致，可以認為酵母將更多的糖發酵生成了酒精，使發酵較徹底，也就造成了非糖固形物的質量濃度勢必有所降低。

3 結語

將生物酸化浸米技術應用到黃酒釀造生產中，研究其對浸米環節及發酵過程和成品的影響。采用接種Lactobacillus plantarum CGMCC7184的生物酸化浸米技術能消除浸米環節的臭味，能使機械化黃酒生產中達到合格酸度的浸漬時間至少縮短1 d，并能提高漿水中乳酸的質量濃度；大幅降低漿水中生物胺質量濃度，有利于生產的安全性；能明顯降低碎米率，提高浸漬米的淀粉質量分數，降低淀粉糊化焓值，有利于節省蒸汽用量。使用生物酸化米進行黃酒釀造，發酵過程正常，生清酒理化指標符合標準，且酒精度有所提高，總酸質量濃度略有降低。感觀品評表明生物酸化浸米起到賦予酒體風味更協調的作用。

[1]方心芳.中國酒文化和中國名酒[M].北京：中國食品出版社，1989：117-131.

[2]謝廣發.黃酒釀造技術[M].北京：中國輕工業出版社，2010：72-98．

[3]毛青鐘，俞關松.黃酒生產中不同品種米浸米特性的研究[J].釀酒，2010，37（4）：70-73.MAO Qingzhong，YU Guangsong.Different varieties of Chinese rice wine production characteristics of rice-dip-meter[J].Liquor Making，2010，37（4）：70-73.（in Chinese）

[4]汪建國，汪陸翔.大米品種和品質與黃酒釀造關系的探討[J].中國釀造，2006，9：60-63.WANG Jianguo，WANG Luxiang.Discussion on the relationship between rice and rice wine brewing[J].China Brewing，2006，9：60-63.（in Chinese）

[5]毛青鐘.黃酒浸米漿水及其微生物變化和作用[J].釀酒科技，2004，3：73-76.MAO Qingzhong.Seriflux of yellow rice wine and its microbe change and functions[J].Liquor-making Science and Technology，2004，3：73-76.（in Chinese）

[6]姬中偉，黃桂東，毛健，等.浸米時間對黃酒品質的影響[J].食品與機械，2013，29（1）：49-52.JI Zhongwei，HANG Guidong，MAO Jian，et al.Effect of soaking time of rice on the quality of Chinese rice wine[J].Food and Machinery，2013，29（1）：49-52.（in Chinese）

[7]程斐，周高峰，謝廣發，等.適用于黃酒生物酸化浸米的乳酸菌的篩選[J].食品與生物技術學報，2013，32（10）：1-5.CHENG Fei，ZHOU Gaofeng，XIE Guangfa，et al.Screening of lactic acid bacteria suitable for biological acidification of rice soaking in Chinese rice wine[J].Jounal of Food Science and Biotechnology，2013，32（10）：1-5.（in Chinese）

[8]郭燕，梁俊，李敏敏，等.高效液相色譜法測定蘋果果實中的有機酸[J].食品科學，2012，33（2）：227-230.GUO Yan，LIANG Jun，LI Mingming，et al.Determination of organic acids in apple fruits by HPLC[J].Food Science，2012，33（2）：227-230.（in Chinese）

[9]Pineda A，Carrasco J，Pena-farfal C，et al.Preliminary evaluation of biogenic amines content in Chilean young varietal wines by HPLC[J].Food Control，2012，23（1）：251-257.

[10]SIMT A Y，DU TOIT W J，DU TOIT M.Biogenic amines in wine：understanding the headache[J].S Afr J Enol Vitic，2008，29（2）：109-127.

[11]Joosten H，Nnuez M.Prevention of histamine formation in cheese by bacteriocin-producing lactic acid bacteria[J].Appl Environ Microbiol，1996，62（4）：1178-1181.

[12]Herrero-Fresno A，Matinez N，Sanchez-llana E，et al.Lactobacillus casei strains isolated from cheese reduce biogenic amine accumulation in an experimental model[J].International Journal of Food Microbiology，2012，157（2）：297-304.

[13]閔偉紅，李里特，王朝輝.乳酸菌發酵對大米淀粉物理化學性質的影響[J].食品科學，2004，25（10）：73-77.MIN Weihong，LI Lite，WANG Zhaohui.Effects of lactic acid bacteria fermentation of rice starch on physical properties[J].Food Science，2004，25（10）：73-77.