一種低度芡實酒理化功能性質分析

張 汆， 蔡華珍， 陳志宏， 何曉偉

（滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000）

芡實是屬于睡蓮（Nymphaeaceae）族的一種水生植物芡（Euryle ferox，EF）的成熟種仁。芡實俗稱雞頭米，在中國、印度、俄羅斯和日本等國家均有分布，是一種傳統滋補食材。在印度，將芡實種仁加工成一種稱為“Makhanna”的休閑食品，很受消費者的歡迎[1-2]。據《本草綱目》記載：芡實“味甘、澀，性平，無毒”。具有“補中益氣，提神強志，耳目聰明”等功效[3]。芡實的諸多保健功能和膳食療效也得到了許多現代研究的證實[4]，Lee等[5]研究發現，芡實提取物具有很高的游離基清除活性和抗脂質過氧化能力。Das等[6]報道，“Makhanna”提取物具有潛在的活性氧清除活性和心臟保護功能。但是，現有研究均不能明確芡實中真正發揮生理保健功效的物質組分有哪些。

在中國、印度、日本和韓國等國，芡實主要作為一種傳統中藥材和保健食品使用，是一種很好的藥食兼用材料。芡實中含有很低的脂類 （質量分數0.1%），淀粉含量豐富（質量分數78%～83%），蛋白質含量與谷類接近（質量分數9.7%），此外，還含有豐富的礦物質，如鋅（42.9～66.0 mg/kg）和鐵（1 994～2 236 mg/kg）[3]，其組成非常適宜于作為釀酒原料。

目前，保健酒的生產一般有兩種方式，一種是將一定的保健材料浸泡在白酒中，以溶解其中的保健組分；另一種是將各種淀粉基材料與一定比例保健食材配比后進行混合發酵，利用原料中原有功能組分及其發酵期間形成的功能組分的富集和生物轉化，以期得到不同保健功效的產品，如蒲公英酒、靈芝酒[7-8]。目前，關于芡實深加工方面的文獻報道很少，作者根據醫藥典籍和前期研究，采用一定比例的芡實和糯米（Oryza sativa L.），研制出一種低度芡實酒，作者對新釀芡實酒和成熟芡實酒 （陳釀1年）的理化性質和體外抗氧化活性進行了分析，擬通過分析，對該芡實酒的保健作用做初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮芡實種子：2010年10月購自安徽滁州當地市場，芡種子脫殼后，取芡實仁，粗粉（過20目篩網），即得芡實粉；糯米，購自安徽滁州當地市場，為長粒型糯米；混合發酵劑：高活性釀酒曲和增香釀酒曲：購自湖北安琪酵母股份有限公司，按質量比3∶1的比例混合加入發酵基質中，總添加量為質量分數1.0%。

1.2 化學試劑

福林酚試劑（Folin-Ciocalteu reagent），沒食子酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane）、鹽酸、焦性沒食子酸、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、維生素 C（VC）、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、氯化亞鐵、乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na）等試劑：上海化學試劑集團公司產品；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·，純度＞97.0%）和菲咯嗪（Ferrozine）：Sigma-Aldrich試劑公司。

沒食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁等單體酚對照品：購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙酸等流動相試劑均為色譜純。

1.3 芡實酒制備

將芡實粗粉與糯米以質量比30∶70的比例混合，加入其質量1.5倍的水，混合，室溫浸泡1～2 h，放入籠屜中蒸40 min。取出，室溫冷卻至35～40℃，加入質量分數1%的混合發酵劑，拌勻后，裝入發酵容器內，于28～30℃培養箱內發酵30 d。發酵結束后，采用壓濾方式分離液相，所得液體室溫靜置30 d，待酒液澄清透明時，將上層酒液用虹吸法轉移至干凈容器內，此為芡實新酒。新酒于室溫下避光貯藏1年，即得芡實成熟酒。

1.4 芡實酒理化性質

采用GB/T13662-2008黃酒的質量分析方法，分別對芡實酒中的感官特性、總糖、非糖固形物、酒精度、pH值、總酸、氨基酸態氮含量進行了分析。

采用凱氏定氮法對酒樣中的總蛋白質質量分數進行測定，氮換算系數取6.25；采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法對酒樣中的還原糖含量進行測定；采用L-8900型氨基酸自動分析儀對酒樣中的游離氨基酸組成進行分析；以沒食子酸酸為總酚對照品，采用福林酚試劑（Folin-Ciocalteau）法對酒樣中的總酚含量進行了測定。

酚類物質組成分析：酒樣中酚類物質組成采用美國Waters公司2695型高效液相色譜 （HPLC）儀進行測定，酒中酚類物質用C18反相色譜柱（X BridgeTM柱，250 mm×4.6 mm， 固定相粒徑 5 μm）進行分離，以紫外檢測器進行檢測。

HPLC分析條件：參考文獻[11-12]方法，經反復試驗，確定為：以甲醇和體積分數1%乙酸溶液為流動相，流量1.0 mL/min，柱溫35℃，樣液注入體積5 μL，在280 nm處檢測。以多酚對照品的保留時間定性，峰面積定量。

1.5 體外抗氧化能力分析

總還原力：采用鐵氰化鉀比色法測定；DPPH·清除能力：采用比色法測定；亞硝酸根離子（NO2-）清除活性：采用比色法測定；亞油酸過氧化抑制能力：采用硫氰酸鹽比色法測定。

1.6 數據分析

采用Excel和DPSv7.55數據處理軟件對數據進行分析，采用多重比較法進行顯著性分析（顯著性水平p＜0.05）。試驗數據均重復測定3次，取平均值，表示為平均值±標準差（Mean±SD）。

2 結果與分析

2.1 芡實酒主要營養組分

該芡實酒的制備工藝類似于黃酒，為避免熱敏性組分損失，該酒未經任何加熱處理。從外觀看，芡實新酒呈淺黃色（A420nm=0.167），澄清透明，風味清香，微酸澀。經1年室溫陳釀，芡實成熟酒的顏色逐漸變深（A420nm=0.446），呈深琥珀色，風味更加濃郁。

理化分析結果顯示，與GB/T13662-2008（黃酒）中的清爽型半甜黃酒質量指標相比，所得芡實酒達到半甜黃酒一級標準。芡實新酒和成熟酒在總糖、非糖固形物、總酸、氨基酸態氮、總蛋白質和還原糖等含量方面存在顯著差別（p＞0.01），經1年陳釀后，上述指標均顯著降低，但酒精度和總酚含量變化不大，陳釀1年后略有增加。因實驗所用酒曲中同時含有糖化曲（以霉菌為主）和釀酒曲（以釀酒酵母為主），在芡實酒加工中未經任何熱處理，僅在發酵結束后，直接進行固液分離，再進行室溫靜置陳釀，顯微鏡下的新酒中可以看到許多活的霉菌和酵母，因此，酒中殘留微生物代謝也會導致上述營養組分的降低。此外，霉菌和酵母在代謝過程中產生的各種胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、單寧酶、乳糖酶、蔗糖酶、脂肪酶等在芡實酒陳釀前期仍有活性，致使成熟酒中的總糖、總蛋白和還原糖等組分含量顯著降低。

芡實中含有豐富的酚類物質（0.93 mg/g），而普通糯米中的總酚含量很低（0.18 mg/g），因此，可以認為，該芡實酒中豐富的總酚含量（492.35 mg/L）主要來自于芡實。但與陳釀1年的紹興黃酒相比，其總酚質量濃度不到黃酒（1 159 mg/L）的一半[20]，這可能與黃酒較長的發酵期和相對豐富的原料組成有關。酚類物質作為一種膳食中具有多種生理保健作用的組分，其含量直接影響芡實酒的保健功效。此外，陳釀后芡實酒中總酚質量濃度的少量增加可能與酒中原有聚合酚物質的水解有關。

2.2 氨基酸組成

表2顯示，原料中除甘氨酸外，芡實中的總氨基酸和必需氨基酸含量均顯著高于糯米 （p＞0.01）。經陳釀1年后，芡實新酒中幾乎所有游離氨基酸均顯著降低（p＞0.01），且遠低于陳釀 1年的黃酒（表2）。陳釀芡實酒中，苦味、甜味、鮮味和澀味氨基酸分別降低了 38.06%、35.49%、26.80%和 47.12%，其中以澀味的酪氨酸降低最多，其次是苦味氨基酸，這說明經陳釀后，有利于降低芡實酒的苦澀味，改善其口感。陳釀后，氨基酸含量的顯著降低主要緣于氨基酸與糖類間緩慢的美拉德反應。相比之下，傳統黃酒中高含量的氨基酸可能與其原料組成和發酵時間較長有關。因此，為提高芡實酒中游離氨基酸含量，需在制作工藝和配方方面進一步改善。

2.3 芡實酒中酚類物質組成

采用HPLC法，從兩種芡實酒中鑒定出5種酚類物質，分別為沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯、阿魏酸、槲皮素和蘆丁，還有3～4個吸收峰有待鑒定。已鑒定的5種酚類物質中，除蘆丁外，其他4種多酚物質在成熟芡酒中的含量均高于新酒，尤其是成熟酒中的槲皮素質量濃度（113.51 mg/L）遠高于新酒 （57.76 mg/L）。芡實新酒中，蘆丁質量濃度為23.54 mg/L，經一年陳釀后，成熟酒中蘆丁質量濃度幾乎完全消失，但槲皮素質量濃度幾乎增加了1倍（表2和圖1）。根據蘆丁和槲皮素的分子結構式（圖2），不難推測：在貯存期間，芡實新酒中的蘆丁組分經水解轉變為槲皮素，該過程在酸性條件下一般是可以發生的。此外，成熟芡實酒的HPLC圖譜峰數多于新酒，在保留時間8～10 min間出現3個新的吸收峰，說明陳釀期間形成了一些新的物質，這些組分有待進一步分析鑒定。

表1 芡實酒及其原料中氨基酸的組成Table 1 Amino acid contents of the EF wines and its materials

2.4 芡實酒體外抗氧化活性

2.4.1 總還原性 芡實酒的總還原性排列順序為：新酒＞0.1 mg/mL VC溶液＞成熟酒＞0.05 mg/mL VC溶液＞體積分數15%乙醇溶液（圖3），且不同樣品間差異顯著（p＞0.01）。結果表明，芡實酒具有很強的還原力，尤其是芡實新酒的還原力顯著高于0.1 mg/mL VC溶液和成熟酒。而體積分數15%乙醇溶液還原性極低，這說明芡實酒強的還原力主要源于其中豐富的還原糖和總酚（表1）。

表2 芡實酒中部分酚類物質質量濃度Tablele 2 Concentrations of identified phenolic components in the EF wines （mg/L）

圖1 多酚標準物質和芡實酒樣的HPLC-UV色譜圖Fig.1 HPLC-UV chromatograms of polyphonic standards and the EF wines

圖2 蘆丁（1）和槲皮素（2）的分子結構式Fig.2 Molecular structures of（1） rutin and （2） quercetin

圖3 芡實酒和VC溶液的總還原力Fig.3 Total reducing power of wines

2.4.2 DPPH·清除活性 與還原力分析結果相似，0.10、0.05 mg/mL VC溶液的DPPH·清除活性遠高于成熟芡酒，體積分數15%乙醇水溶液幾乎不顯示任何DPPH·清除活性（圖3）。然而，在評價新酒的DPPH·清除活性時，隨著新酒樣品的加入，反應體系呈明顯渾濁狀態，無法通過比色法進行分析，但仍能看到體系原有的紫紅色在加入新酒后，發生明顯褪色，說明新酒也具有較強的清除活性。有關芡實新酒使反應體系變渾濁的原因還有待分析。

2.4.3 NO2-清除能力 芡實酒和VC溶液的NO2-清除能力隨著用量的增加而顯著增加（p＜0.01），其中，0.1 mg/mL的VC溶液的NO2-清除能力最高，其次是芡實新酒和成熟酒（圖4）。體積分數15%的乙醇溶液的NO2-清除能力最低。結果表明，芡實新酒和成熟酒均具有非常強的NO2-清除活性。

2.4.4 亞油酸過氧化抑制活性 芡實新酒和成熟酒均具有很強的亞油酸過氧化抑制能力，在4 h內其過氧化抑制率從20%左右迅速增加至80%左右，此后變化趨于平緩，10 h后，抑制率仍可保持在80%左右，且芡實新酒和成熟酒間無顯著差別 （p＞0.05）（圖 5）。

圖4 芡實酒和VC溶液的DPPH·清除活性Fig.4 DPPH·-scavenging activities of wines and VC solutions

圖5 芡實酒和VC溶液的NO2-清除能力Fig.5 NO2--scavenging capacities of the wines and VC solutions

圖6 芡實酒和VC溶液的亞油酸過氧化抑制能力Fig.6 Linoleic acid peroxidation inhibition of the wines

以上4種不同體外抗氧化評價方法的結果均表明，芡實酒具有很強的體外抗氧化活性，部分抗氧化性能與黃酒接近[16]。芡實酒體外抗氧化活性與其中的乙醇無關，而與其中豐富的還原糖、多酚類物質及氨基酸可能具有密切關系。

3 結 語

研究表明，芡實酒營養豐富，富含各種必需氨基酸和總酚，芡實新酒和成熟酒均顯示出很強的體外抗氧化活性和NO2-清除能力。采用HPLC法對芡實酒中的部分多酚物質組分進行了定性和定量分析，它們包括：沒食子酸、阿魏酸、槲皮素和蘆丁，且成熟芡酒中含有更高含量的多酚物質。因此，芡實酒，尤其是經1年陳釀成熟酒，不僅含有更多的活性組分和更好的風味，而且具有很強的體外抗氧化活性，顯示出很大的生理保健潛力。

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