磷酸二酯酶抑制劑對枯草芽孢桿菌發酵環磷腺苷的影響

朱曉宏， 朱曉慧， 魏 薇

（江蘇省微生物研究所有限公司，江蘇 無錫 214063）

環磷腺苷具有調節生物體內很多酶催化反應的功能，體內很多激素的作用也是通過環磷腺苷區進行的，起著激素媒介物質的作用[1]。

現已證明環磷腺苷（cAMP）是睪丸甾酮、雌激素、腎上腺激素、甲狀腺激素及胎盤激素等許多激素的第二信使。當各種激素與細胞表面作用點接觸時，發動細胞內三磷酸腺苷（ATP）轉化成環磷腺苷（cAMP）。細胞內環磷腺苷（cAMP）的濃度變化又引起了細胞各種代謝的變化。而且環磷腺苷（cAMP）與細胞內蛋白質合成、脂肪分解、類固醇合成均有關系。環磷腺苷（cAMP）與惡性腫瘤、內分泌之間的關系十分密切。在特定條件下，環磷腺苷（cAMP）對癌細胞具有控制作用，對冠心病、牛皮癬等有緩解作用。

目前在我國，環磷腺苷（cAMP）主要作為醫藥品被應用。環磷腺苷（cAMP）在醫藥上主要作為急性心肌梗塞搶救藥并用于冠心病、糖尿病、氣喘、牛皮癬等疾病的治療。

生物代謝途徑中，磷酸二酯酶及其同工酶能夠使環磷腺苷降解[2]，破壞磷酸二酯酶及其同工酶，成為提高環磷腺苷發酵水平的有效途徑。

本研究采用菌種枯草芽孢桿菌Bacillus.subtilis jsim-1277已經是腺苷酸脫氨酶陰性[3]減少了磷酸二酯酶活性，作者試驗了多種磷酸二酯酶同工酶抑制劑，有效提高了環磷腺苷的發酵水平。

1 材料與方法

1.1 菌種

作者所在研究室篩選育種得到的Bacillus.subtilis jsim-1277。該菌株與目前國內鳥苷發酵菌種Bacillus.subtilis jsim-G518[4]相似，同樣源自肌苷產生菌Bacillus.subtilis jsim-1019。

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基 葡萄糖2.0 g/dL，蛋白胨1.0 g/dL，玉米漿 0.3 g/dL，NaCl 0.3 g/dL；pH 7.0。 （固體培養基加瓊脂2 g/dL）

1.2.2 發酵培養基 葡萄糖6.0 g/dL，尿素1.0 g/dL，酵母粉1.0 g/dL，豆餅水解液0.3 g/dL，K2HPO41.0 g/dL，NaF 0.05 g/dL，MgSO40.1 g/dL；pH 7.0。依據實驗需要添加 1，5，10，20，50 mg/L 的酚噻嗪、 西馬多丁、硫苯唑林、丙苯氮嘌呤、茶堿等磷酸二酯酶抑制劑。

1.3 搖瓶發酵試驗

1.3.1 搖瓶種子培養 接一環生長良好的斜面培養物至裝有30 mL種子培養基的500 mL三角瓶中培養，旋轉式搖床，頻率210 r／min，溫度36℃ ，培養18 h。

1.3.2 搖瓶發酵培養 將生長良好的種子液接至裝有30 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中培養，接種體積分數10%，旋轉式搖床，頻率210 r／min，溫度36℃，培養72 h后測定環磷腺苷質量濃度。培養條件與鳥苷發酵條件相似[5]。

1.4 分析方法

高效液相色譜法。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液 （含0.01 mol/L四丁基溴化銨，用磷酸調節pH值至4.3）-乙腈（85∶15）為流動相，檢測波長為258 nm。標準品溶液0.2 mg/mL，取20 μL注入液相色譜儀，按外標法以峰面積計算測定。

2 結果與分析

2.1 酚噻嗪的影響

在發酵培養基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的酚噻嗪，與不添加的常規培養基發酵進行對照，結果見表1。

表1 酚噻嗪對環磷腺苷發酵的影響Table 1 Effect of various concentration of phenothiazine on cAMP accumulation

酚噻嗪的加入非但沒有提高，還大大降低了環磷腺苷的生產能力。發酵過程中，菌自溶時間提前，可能與酚噻嗪對菌種具有毒性有關。

2.2 西馬多丁的影響

在發酵培養基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的西馬多丁，與不添加的常規培養基發酵進行對照，結果見表2。

表2 西馬多丁對環磷腺苷發酵的影響Table 2 Effect of various concentration of cemadotin on cAMP accumulation

西馬多丁在低濃度可以提高環磷腺苷的生產能力，在5 mg/L添加量時，可以提高產量16%，而添加量過大則反而減產。可能與西馬多丁對磷酸二酯酶同工酶的抑制有關。

2.3 硫苯唑林的影響

在發酵培養基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的硫苯唑林，與不添加的常規培養基發酵進行對照，結果見表3。

表3 硫苯唑林對環磷腺苷發酵的影響Table 3 Effect of various concentration of thibenzazoline on cAMP accumulation

硫苯唑林的加入同樣沒有提高，并大大降低了環磷腺苷的生產能力。發酵過程中，菌自溶時間也提前，可能與硫苯唑林對菌種具有毒性有關。

2.4 丙苯氮嘌呤的影響

在發酵培養基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的丙苯氮嘌呤，與不添加的常規培養基發酵進行對照，結果見表4。

表4 丙苯氮嘌呤對環磷腺苷發酵的影響Table 4 Effect of various concentration ofbenzene nitrogen purine on cAMP accumulation

丙苯氮嘌呤的加入同樣沒有提高，并大大降低了環磷腺苷的生產能力。發酵過程中，菌自溶時間提前更明顯，可能與丙苯氮嘌呤對菌種具有毒性有關。

2.5 氨茶堿的影響

在發酵培養基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的氨茶堿，與不添加的常規培養基發酵進行對照，結果見表5。

氨茶堿可以提高環磷腺苷的生產能力，在5 mg/L添加量時，可以提高產量10.7%，隨著添加質量濃度的提高，環磷腺苷增產能力維持在9%～10%左右，可能與氨茶堿對某類磷酸二酯酶同工酶產生了抑制有關。

表5 氨茶堿對環磷腺苷發酵的影響Table 5 Effect of various concentration of aminophylline on cAMP accumulation

2.6 西馬多丁與氨茶堿聯合使用的影響

西馬多丁與氨茶堿共同使用，按照之前試驗中最佳的3個質量濃度組合，結果見表6。

表6 西馬多丁與氨茶堿聯用對環磷腺苷發酵的影響Table 6 Effect of cemadotin combined with aminophylline on cAMP accumulation

西馬多丁和氨茶堿聯用，具有提高環磷腺苷的生產能力，且提高能力相互間有加成效果，可能西馬多丁和氨茶堿分別抑制的磷酸二酯酶同工酶類別不同，協同減少了菌對自身產物環磷腺苷的降解，實現了增產的效果。

3 結語

環磷腺苷產生菌枯草芽孢桿菌Bacillus.subtilis jsim-1277能在某些磷酸二酯酶同工酶抑制劑的存在下，提高環磷腺苷的產量。其中西馬多丁和氨茶堿聯用，最多可以增產28%，達到9.14 g/L，提高非常顯著。

[1]Shandar R R，Zhu J S，Baron A D.Glueosamine infusion in rat smimics the beta-cell dysfunction of non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Metabolism，l998，47：573．

[2]王曉英，吳俊芳，張均田.選擇性磷酸二酯酶抑制劑研究進展[J].中國藥理學通報，2000，16（2）：121-124.WANG Xiaoying，WU Junfang，ZHANG Juntian.Progress in selective inhibitors of cyclic nucleotide phosphodiesterase[J].Chinese Pharmacological Bulletin，2000，16（2）：121-124.（in Chinese）

[3]柏建新，朱曉宏，張一平，等.肌苷菌核酸代謝關鍵酶缺失和形成選育腺苷茵的研究[J].微生物學通報，2003，30（2）：52-56.BAI Jianxin，ZHU Xiaohong，ZHANG Yiping，et al.Study on the microorganism fermentation of adenosine with mutative strains of lack of or producing some important enzymes in nucleic acid metabolism[J].Microbiology，2003，30（2）：52-56.（in Chinese）

[4]盛翠，張一平，陸茂林.原生質體紫外誘變選育鳥苷高產菌株[J].食品與生物技術學報，2009，28（2）：279-283.SHENG Cui，ZHANG Yiping，LU Maolin.Study on breeding up high-yield strain of guanosine by protoplast mutagensis[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（2）：279-283.（in Chinese）

[5]杜郭君，張一平，王紅連，等.鳥嘌呤核苷補料發酵條件研究[J].食品與生物技術學報，2005，24（5）：21-24.DU Guojun，ZHANG Yiping，WANG Honglian，et al.Studies on feeding condition of guanosine fermentation[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2005，24（5）：21-24.（in Chinese）