NHEJ信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)與宮頸鱗癌同步放化療敏感性的關(guān)系

許義松，周文靜，祁曉麗，席 佩，戴鵬高

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

宮頸癌是常見的一種女性惡性腫瘤，全世界每年新增45萬(wàn)～50萬(wàn)例患者，其中鱗癌為最常見的病理類型。在我國(guó)，近十幾年來(lái)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)［1-2］。目前，將放射治療及以順鉑為基礎(chǔ)的化學(xué)藥物治療相結(jié)合的治療方式，已成為臨床上治療的IIB期及以上分期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)方法，通常稱之為同步放化療。相對(duì)于傳統(tǒng)的單獨(dú)放療及其他治療手段，接受同步放化療的患者群體擁有更長(zhǎng)的生存期及更為輕微的毒副作用。然而，仍有相當(dāng)一部分患者無(wú)法從中受益［3-4］。因此，發(fā)現(xiàn)與宮頸癌放化療敏感性的分子標(biāo)志物具有重要意義。

同步放化療主要通過(guò)誘發(fā)各種類型的DNA損傷來(lái)達(dá)到治療腫瘤的效果，其中DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)損傷與殺死腫瘤細(xì)胞密切相關(guān)［5］。細(xì)胞通過(guò)激活 NHEJ和 HR(homologous recombination)信號(hào)通路修復(fù)DSB損傷，其中NHEJ是主要的修復(fù)途徑［6-9］。腫瘤細(xì)胞的NHEJ系統(tǒng)與細(xì)胞生存密切相關(guān)，因此也是放化療敏感性的重要決定因素。多項(xiàng)研究表明，NHEJ信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)與乳腺癌［10］、鼻咽癌［11］、咽喉癌［12］等惡性腫瘤的放/化療敏感性密切有關(guān)。本研究主要探索NHEJ信號(hào)通路中關(guān)鍵基因 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C的mRNA表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者同步放化療敏感性的關(guān)系，進(jìn)而找到預(yù)測(cè)宮頸鱗癌同步放化療敏感性的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取42名于2013年11月至2014年5月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的宮頸鱗癌患者。所有組織樣本均為治療前的活檢標(biāo)本，并且病理檢查均為鱗癌;依據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(The International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)制定的宮頸癌國(guó)際臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。臨床分期為:ⅠB～ⅢB期，其中ⅠB期1例，ⅡA期1例，ⅡAⅡ期3例，ⅡB期15例，ⅢB期22例);在42例樣本中有34例樣本屬于中分化程度，高分化程度有3例，低分化程度有5例;年齡47～78歲，中位年齡60歲。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征求所有參與患者同意。

42例患者均接受同步放化療治療。具體放療方案為:采用調(diào)強(qiáng)適形放射治療行全盆腔體外照射，每次2Gy，每周5次，總劑量為50Gy，同時(shí)加以腔內(nèi)近距離照射，每周4～5次，A點(diǎn)總劑量為24～25Gy。同步化療方案為:在放療期間采用靜脈滴注方式給予順鉑40 mg/m2，每周1次，共6周。

1.2 儀器與試劑

ABI PRISM?7500 Real Time PCR System(Life);Nanodrop核酸定量?jī)x(Thermo Forma);TRIzol試劑(Invitrogen);一步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa);引物及探針(上海生工生物有限公司合成)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織中總RNA的提取 用TRizol法提取新鮮冰凍穿刺組織中總RNA，每50～100 mg勻漿組織中加入1 mL Trizol。用Nanodrop紫外分光光度儀測(cè)定RNA的濃度及純度，并通過(guò)0.01g/mL瓊脂糖凝膠鑒定RNA的完整性。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 從Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并下載 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC，DCLRE1C及GAPDH基因的mRNA序列。選擇欲設(shè)計(jì)引物探針的位置，然后將該位置的序列導(dǎo)入Primer Express 5.0軟件，進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)。利用Primer Blast在線軟件對(duì)引物特異性進(jìn)行評(píng)估。引物探針序列見表1。

1.3.3 熒光定量PCR檢測(cè) 反應(yīng)體系配置如下:每個(gè)反應(yīng)體系體積為20 μL，其中上下游引物用量為500 nmol/L，熒光探針為200 nmol/L，RNA模板為50 ng，TaKaRa Ex Taq HS為2 U，One Step RT-PCR BufferⅢ為10 μL，PrimeScript RT enzyme MixⅡ?yàn)?0.4 μL，Rox Reference Dye Ⅱ(50 ×)為0.4 μL，無(wú) Rnase 超純水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序分兩步，第一步，42℃持續(xù)5 min，95℃持續(xù)10s;第二步，95℃持續(xù)5s，60℃持續(xù)34s，40 個(gè)循環(huán)。每一個(gè)反應(yīng)做兩個(gè)平行反應(yīng)，最后取平均值。每個(gè)目的基因的表達(dá)值均以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算公式為2-△Ct，其中△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。實(shí)驗(yàn)中6個(gè)基因及內(nèi)參基因(GAPDH)的擴(kuò)增曲線圖，見圖1。

表1 7個(gè)基因的引物及探針序列Tab.1 Primer and probe sequences of seven genes

圖1 7個(gè)基因的擴(kuò)增曲線圖Fig.1 The amplification figure of seven genes

1.4 患者對(duì)同步放化療敏感性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

患者同步放化療結(jié)束3個(gè)月后進(jìn)行復(fù)查，并根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)臨床療效進(jìn)行劃分:1)完全緩解(complete response，CR)——所有靶病灶完全消失;2)部分緩解(partial response PR)——所有靶病灶最大徑之和減小≥30%;3)疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)——靶病灶最大徑之和增加≥20%或有新的病灶出現(xiàn);4)疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)——靶病灶最大徑之和的變化介于PR和PD之間［13］。將近期療效CR患者視為對(duì)同步放化療有應(yīng)答，近期療效PR，SD和PD患者視為對(duì)同步放化療無(wú)應(yīng)答。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用χ2檢驗(yàn)分析各基因mRNA表達(dá)水平與同步放化療敏感性之間的關(guān)系，用Logistic回歸進(jìn)一步分析同步放化療敏感性相關(guān)因素。當(dāng)P＜0.05時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C mRNA表達(dá)與宮頸鱗癌同步放化療敏感性的關(guān)系

據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，42例患者對(duì)同步放化療有應(yīng)答的為29例，無(wú)應(yīng)答的為13例。用每個(gè)基因mRNA表達(dá)值的中位值來(lái)定義其表達(dá)水平，其中mRNA表達(dá)值≥中位值計(jì)為高表達(dá)，mRNA表達(dá)值＜中位值則計(jì)為低表達(dá)。6個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平與同步放化療敏感性之間的關(guān)系，見表2。結(jié)果表明，XRCC6 mRNA高表達(dá)的患者在CR組和PR+SD+PD組中分別占34.5%和84.6%，XRCC6 mRNA低表達(dá)患者在CR組和PR+SD+PD組中分別占65.5%和15.4%(P=0.003)。在 XRCC4，LIG4，XRCC5，PRKDC 及DCLRE1C mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組中，患者應(yīng)答率沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.2 宮頸鱗癌同步放化療敏感性相關(guān)因素Logistic回歸分析

將患者的臨床信息與XRCC6 mRNA表達(dá)一起納入Logistic多因素回歸分析。結(jié)果顯示，只有XRCC6表達(dá)水平與放化療敏感性有顯著性關(guān)聯(lián)，而患者的年齡、瘤塊大小和FIGO分期則與患者的臨床療效無(wú)關(guān)，XRCC6高表達(dá)是降低同步放化療敏感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR 10.694，95%CI 1.872～61.094;P=0.008)，見表3。

表2 NHEJ信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)與宮頸鱗癌同步放化療敏感性的關(guān)系Tab.2 The relationship between mRNA levels of genes involved in the NHEJ pathway and concurrent chemoradiotherapy sensitivity in squamous cell cervical cancer

表3 宮頸鱗癌同步放化療敏感性相關(guān)因素Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of influential factors on synchronous chemoradiotherapy sensitivity in squamous cell cervical carcinoma

3 討論

NHEJ信號(hào)通路可以修復(fù)由同步放化療引發(fā)的DSB損傷［6］。由于其修復(fù)過(guò)程不需要同源DNA模板，可以發(fā)生在整個(gè)細(xì)胞周期中，是修復(fù)DSB 的 主 要 信 號(hào) 通 路［8-9］。XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C參與整個(gè)修復(fù)過(guò)程，這些關(guān)鍵基因的表達(dá)水平會(huì)影響該通路的功能，因而可以進(jìn)一步影響細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。本研究通過(guò)qRT-PCR法測(cè)定42例宮頸鱗癌患者 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C的mRNA表達(dá)值，在應(yīng)答組的29例樣本中，XRCC4 PRKDC分別有1例樣本未檢測(cè)出表達(dá)值。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，XRCC6的mRNA表達(dá)水平與患者接受同步放化療治療的敏感性密切相關(guān)，XRCC6低表達(dá)患者對(duì)同步放化療敏感，且近期療效更好。

XRCC6編碼的Ku70蛋白是NHEJ信號(hào)通路中最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子之一［14-15］。DSB發(fā)生時(shí)，Ku復(fù)合物(Ku70和Ku80)識(shí)別并結(jié)合到DSB末端，并為該通路中其他修復(fù)蛋白的結(jié)合提供支架［16］。大量研究表明，腫瘤細(xì)胞中Ku70表達(dá)與放化療抵抗有密切的關(guān)系。采用基因敲除技術(shù)去除小鼠胚胎干細(xì)胞中XRCC6基因，建立XRCC6基因敲除鼠動(dòng)物模型，小鼠表現(xiàn)出對(duì)電離輻射異常敏感和生長(zhǎng)遲緩等現(xiàn)象［17］。體外研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向人宮頸癌HeLa細(xì)胞系轉(zhuǎn)染靶向抑制Ku70的ShRNA來(lái)抑制細(xì)胞系Ku70蛋白表達(dá)，可以顯著提高細(xì)胞的對(duì)化療藥物的敏感性［18］。最近用免疫組化法檢測(cè)治療前、后IB-IIA期宮頸癌組織中Ku70蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ku70的表達(dá)量在放療殘留組織中增加［19］。本實(shí)驗(yàn)與相關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果一致，提示XRCC6 mRNA表達(dá)水平升高可導(dǎo)致Ku70蛋白表達(dá)增加及NHEJ修復(fù)能力增強(qiáng)，最終引起對(duì)同步放化療的反應(yīng)降低。XRCC4，XRCC5，LIG4，PRKDC和DCLRE1C基因與腫瘤的放化療敏感性未發(fā)現(xiàn)存在顯著相關(guān)性。一方面可能是由于XRCC6引起的放化療敏感性是通過(guò)其他細(xì)胞信號(hào)通路影響細(xì)胞的生長(zhǎng);另一方面所用的樣本量偏小，尚未能發(fā)現(xiàn)這些基因與腫瘤放化療敏感性。由于研究的樣本都為穿刺組織，組織量少，因此本實(shí)驗(yàn)只是在RNA水平上來(lái)驗(yàn)證，且樣本量非常有限，更加可靠性的結(jié)論需要大樣本研究驗(yàn)證。

綜上所述，NHEJ信號(hào)通路中XRCC6 mRNA表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者接受同步放化療治療的敏感性密切相關(guān)。在患者進(jìn)行治療之前，先對(duì)其活檢組織中XRCC6 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，這樣就能有效地預(yù)測(cè)其臨床療效。

［1］ 胡尚英，鄭榮壽，趙方輝，等.1989至2008年中國(guó)女性子宮頸癌發(fā)病和死亡趨勢(shì)分析［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，36(2):119-125.

［2］ SHI JF，CANFELL K，LEW JB，et al.The burden of cervical cancer in China:synthesis of the evidence［J］.International Journal of Cancer 2012，130(3):641-652.

［3］ DUBAY RA，ROSE PG，O'MALLEY DM，et al.E-valuation of concurrent and adjuvant carboplatin with radiation therapy for locally advanced cervical cancer［J］.Gynecologic Oncology，2004，94(1):121-124.

［4］ 甘祖煥，甘浪舸 譚毅.同步放化療在中晚期宮頸癌中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué)，2014，7(4):371-376.

［5］ LESKOV KS，CRISWELL T，ANTONIO S，et al.When X-ray-inducible proteins meet DNA double strand break repair［J］.Seminars in Radiation Oncology，2001，11(4):352-372.

［6］ BURMA S，CHEN BP，CHEN DJ.Role of non-homologous end joining(NHEJ)in maintaining genomic integrity［J］.DNA Repair(Amst)，2006，5(9-10):1042-1048.

［7］ WAN GENT DC，HOEIJMAKERS JH，KANAAR R.Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection［J］. Nature Reviews Genetics，2001，2(3):196-206.

［8］ SHRIVASTAV M，DE HARO LP，NCKOLOFFL JA.Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice［J］.Cell Research，2008，18(1):134-147.

［9］ LIEBER M R，MA Y，PANNICKE U，et al.Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining［J］.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2003，4(9):712-720.

［10］ SODERLUND LK，QUESETH S，F(xiàn)OMANDER T，et al.Low expression of Ku70/80，but high expression of DNA-PKcs，predict good response to radiotherapy in early breast cancer［J］.International Journal of Oncology，2010，37(6):1547-1554.

［11］ZHOU X，TIAN D，WANG S，et al.Expressions of genes related to genome stability and DNA repair in nasopharyngeal carcinoma clustering families［J］.The Chinese-German Journal of Clinical Oncology，2010，8(12):713-718.

［12］ HAYASHI J，SAKATA KI，SOMEYA M，et al.Analysis and results of Ku and XRCC4 expression in hypopharyngeal cancer tissues treated with chemoradiotherapy［J］.Oncology Letters，2012，4(1)，151-155.

［13］ TSUCHIDA Y，THERASSE P.Response evaluation criteria in solid tumors(RECIST):New guidelines［J］.Medical and Pediatric Oncology，2001，37(1):1-3.

［14］ LEHMAN J A，HOELZ D J，TURCHI J J.DNA-dependent conformational changes in the Ku heterodimer［J］.Biochemistry，2008，47(15):4359-4368.

［15］ZHANG Z，ZHU L，LIN D，et al.The three-dimensional structure of the C-terminal DNA-binding domain of human Ku70［J］.The Journal of Biological Chemis-try，2001，276(41):38231-38236.

［16］ LIEBER M R.The mechanism of human nonhomologous DNA end joining［J］.The Journal of Biological Chemistry，2008，283(1):1-5.

［17］GU Y，SEIDL K J，RATHBUN G A，et al.Growth retardation and leaky SCID phenotype of Ku70-deficient mice［J］.Immunity，1997，7(5):653-665.

［18］TIAN X，CHEN G，XING H，et al.The relationship between the down-regulation of DNA-PKcs or Ku70 and the chemosensitization in human cervical carcinoma cell line HeLa［J］.Oncology Reports，2007，18(4):927-932.

［19］ BESKOW C，SKIKUNIENE J，HOLGERSSON A，et al.Radioresistant cervical cancer shows upregulation of the NHEJ proteins DNA-PKcs，Ku70 and Ku86［J］.British Journal of Cancer，2009，101(5):816-821.