白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷生成黃芩素的研究

楊 希，劉伶文，王璐倩，陳飛宇，沈苗苗，蒲峻毅

（西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安710048）

黃芩是歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，屬唇形科.黃芩中具有明顯藥理作用的是黃芩苷（含量大于10%）和黃芩素（約1%）［1］，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用［2］.藥物代謝研究［3］發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在腸道內(nèi)難以被直接吸收，轉(zhuǎn)化為黃芩素才能被血液吸收而發(fā)揮作用.同時(shí)，大量臨床藥效試驗(yàn)［3］證明，黃芩素的藥理作用強(qiáng)于黃芩苷.

黃芩苷分子中含有葡萄糖醛酸鍵，水解難度大.化學(xué)水解法能耗高，污染大，收率低.Morimoto S［4］等從黃芩的愈傷組織中分離出內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶，最佳反應(yīng)pH為7.0～8.0；李建華等［5］研究發(fā)現(xiàn)水溫50℃浸泡處理時(shí)，黃芩內(nèi)源酶降解黃芩苷的活性最強(qiáng)，但是對(duì)黃芩進(jìn)行炮制處理后，黃芩內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶被滅活，無(wú)法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化；賀美等［6］采用米曲霉活化法，轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素，轉(zhuǎn)化率達(dá)到40.72%；陳斌［7］利用藍(lán)藻體系轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素，為制備黃芩素尋找到一個(gè)新的途徑；劉伶文等［8］采用人體腸道菌轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素.目前，微生物發(fā)酵技術(shù)，反應(yīng)溫和，無(wú)污染，轉(zhuǎn)化率較高，選用微生物進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素，是制備黃芩素的一個(gè)新方向.由于白腐真菌能分泌多種酶，且嗜酸真菌還能產(chǎn)生多種糖苷酶［9］，因此本實(shí)驗(yàn)采用白腐真菌對(duì)黃芩苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，期望得到黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素的一個(gè)生物模型.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

黃芩苷（西安小草植物科技有限公司），黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品（98%陜西省食品藥品檢驗(yàn)所），白腐真菌（中科院成都生物研究所），市售新鮮馬鈴薯，葡萄糖，甲醇（95%，色譜純），聚酰胺薄膜展層（10cm×10cm）.

1.2 儀器

分析用高效液相色譜儀（Agilent Technologies-1200series），C18色譜柱（250mm×4.6mm），HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱（杭州匯爾儀器），超凈工作臺(tái)，高速離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5810R），SK5200LH超聲波儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），752N紫外可見(jiàn)分光光度儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）.

1.3 培養(yǎng)基的配制

采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基［10］.新鮮土豆洗凈去皮，切成小塊，稱取200g，加蒸餾水煮爛，用4層紗布過(guò)濾，加入葡萄糖20g，繼續(xù)加熱，攪拌混勻，得1 000mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基.0.1MPa，110℃條件下滅菌20min，自然冷卻.

1.4 白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷模型的建立

1.4.1 生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法 為了探索底物黃芩苷的存在是否可以誘導(dǎo)白腐真菌產(chǎn)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)化酶，設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取黃芩苷1.0g加入到經(jīng)滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，選取長(zhǎng)勢(shì)均勻良好的白腐真菌平板培養(yǎng)基，使用直徑10mm的打孔器在無(wú)菌條件下接入5片直徑為10mm的白腐真菌菌餅，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)80h［11］.

1.4.2 靜態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法 按照1.4.1中的接種方法，無(wú)菌條件下向已滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中接入5片直徑為10mm的白腐真菌菌餅，待菌株活化后，高速冷凍離心收集菌體，洗滌后將菌體懸浮于磷酸緩沖液中，再加入1.0g黃芩苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)時(shí)間為80h.

1.4.3 破壁處理 培養(yǎng)完成后，進(jìn)行超聲波破壁處理，頻率為40kHz，時(shí)間為20min.

1.4.4 白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷轉(zhuǎn)化模型對(duì)照實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)如表1所示.

1.5 轉(zhuǎn)化后檢測(cè)

1.5.1 TLC法快速檢測(cè)黃芩素 以黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，取實(shí)驗(yàn)樣品在聚酰胺薄膜展層上進(jìn)行定性分析.

聚酰胺薄膜展層劑：95%乙醇∶36%乙酸=2∶1（體積比），顯色劑：2%FeCl3乙醇溶液［12］.

1.5.2 HPLC檢測(cè) 精確稱取黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品0.02g，溶解于1mL甲醇，配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待測(cè).將以上各組培養(yǎng)液分別于10 000r／min下離心10min，取上清液濃縮，然后用甲醇定容到30mL，再次離心后取上清液待檢測(cè).色譜條件：流動(dòng)相∶甲醇∶水∶磷酸=65∶35∶0.2（體積比），流速：1mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)275nm，進(jìn)樣量10μL［13］.

表1 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)Table 1 Design of experimental method

1.6 生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)條件的優(yōu)化

對(duì)選定的轉(zhuǎn)化模型中微生物培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得對(duì)黃芩苷的最大轉(zhuǎn)化效率，選用生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.6.1 最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間的確定 固定菌液量為1mL，黃芩苷量為1.0g，分別在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120，132，144h條件下發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃.培養(yǎng)完成后離心取上清液.采用吸光光度法在波長(zhǎng)275nm下測(cè)定其吸光度值，以確定黃芩苷的最佳轉(zhuǎn)化效率時(shí)間.

1.6.2 最佳接種量的確定 固定黃芩苷量為1.0g，培養(yǎng)時(shí)間為80h.選取長(zhǎng)勢(shì)均勻良好的白腐真菌平板培養(yǎng)基，使用直徑為10mm的打孔器進(jìn)行接種.分別接入1，2，3，4，5片菌餅進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃.培養(yǎng)完成后離心取上清液.采用吸光光度法在波長(zhǎng)275nm下測(cè)定其吸光度值，以此來(lái)確定一定量黃芩苷所需的最佳接種量.

1.6.3 最佳pH的確定 白腐真菌適應(yīng)于微酸性環(huán)境，分別設(shè)置培養(yǎng)基pH為3.5，4.5，5.5，6.5.固定黃芩苷的量為1g，依據(jù)1.6.1和1.6.2所確定的最佳時(shí)間和接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng).培養(yǎng)完成后離心取上清液.采用吸光光度法在波長(zhǎng)275nm下測(cè)定其吸光度值，以此來(lái)確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳pH.

2 結(jié)果與討論

2.1 白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷的模型

2.1.1 TLC法檢測(cè)結(jié)果 按照1.4.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用TLC法快速檢測(cè)黃芩素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

由圖1可見(jiàn)，B組實(shí)驗(yàn)液在黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)位置具有明顯斑點(diǎn)，A組出現(xiàn)微弱斑點(diǎn)，且顏色一致，為藥典描述的棕黑色，C組在相應(yīng)位置也出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)，但顏色為墨綠色，不符合藥典描述，即C組產(chǎn)物并非純品黃芩素.由此可初步確定白腐真菌能夠?qū)ⅫS芩苷轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物黃芩素.

2.1.2 HPLC檢測(cè)結(jié)果 按照1.4.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用HPLC對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析.各組實(shí)驗(yàn)的液相色譜圖如圖2所示.黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間約為7.304min.

圖1 轉(zhuǎn)化液TLC圖譜Fig.1 Result of TLC analysis

圖2 各組液相色譜圖Fig.2 Result of HPLC analysis of each group

A組實(shí)驗(yàn)采用的是生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，但是未經(jīng)過(guò)超聲波處理，在相應(yīng)保留時(shí)間內(nèi)只檢測(cè)到極其微量的黃芩素.生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法直接將黃芩苷加入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在白腐真菌自身生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，由于培養(yǎng)基為白腐真菌生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此其在黃芩苷的誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生新的酶.由于未經(jīng)過(guò)超聲波破壁處理，相應(yīng)的胞內(nèi)酶沒(méi)有完全釋放出來(lái)，因此無(wú)法收獲大量的黃芩素.

B組實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，經(jīng)過(guò)超聲波破壁，在7.199min處檢測(cè)到黃芩素，說(shuō)明白腐真菌經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法可以轉(zhuǎn)化黃芩苷，且經(jīng)超聲波破壁后得到黃芩素.按照細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法，黃芩苷被加入到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中可能產(chǎn)生相應(yīng)的酶，參照A組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該酶應(yīng)為胞內(nèi)酶.

C組、D組實(shí)驗(yàn)均采用靜態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，培養(yǎng)基中沒(méi)有黃芩苷，即使經(jīng)超聲波處理也不能得到黃芩素.說(shuō)明靜態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法不能為白腐真菌提供充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也沒(méi)有誘導(dǎo)其產(chǎn)生相應(yīng)的酶，因此未能將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素.

綜上所述及2.1.1結(jié)果，可確定生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法配合超聲波破壁可轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素.

2.2 生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

在以上確定的轉(zhuǎn)化模型基礎(chǔ)上，探討培養(yǎng)條件.不同培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響如圖3所示.由圖3（a）可知，0～96h黃芩素含量不斷增加，在96h達(dá)到峰值，此后趨于平衡.白腐真菌在0～96h之間經(jīng)歷了適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，菌絲體逐漸生長(zhǎng)累積，產(chǎn)酶量增加，黃芩素的產(chǎn)量也逐漸增加.此后到達(dá)衰亡期，菌絲體開(kāi)始凋亡，轉(zhuǎn)化過(guò)程基本停滯，黃芩素產(chǎn)量趨于平衡.因此可選擇96h作為白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素的最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間.

由圖3（b）可知，接種量在1～4片之間時(shí)黃芩素含量不斷增加，此后趨于平衡且伴有下降趨勢(shì).接種量在1～4片之間時(shí)隨著接種量增加，產(chǎn)酶量增加，黃芩素產(chǎn)量隨之增加，當(dāng)達(dá)到5片時(shí)，由于培養(yǎng)基已不能提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌絲體生長(zhǎng)受到影響，產(chǎn)酶量下降，黃芩素產(chǎn)量趨于平衡且伴有輕微下降趨勢(shì).因此可確定當(dāng)料液比為1∶100時(shí)所需菌的最佳量為4片直徑為10mm的菌餅.

圖3 培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 The influence of culture conditions on the conversion efficiency

由圖3（c）可知，pH在3.5～5.5之間時(shí)黃芩素的含量不斷增加，大于5.5以后開(kāi)始下降.白腐真菌的適宜生長(zhǎng)環(huán)境是酸性環(huán)境，在pH 3.5～5.5之間時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)良好，產(chǎn)酶量增加，黃芩素產(chǎn)量也逐漸增加，當(dāng)pH大于5.5以后，菌絲體的生長(zhǎng)代謝受到影響，產(chǎn)酶量下降，黃芩素產(chǎn)量隨之下降.因此可確定白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷生成黃芩素的的最佳pH為5.5.

3 結(jié) 論

（1）生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法可以誘導(dǎo)菌種表達(dá)特定的代謝酶，易于生物轉(zhuǎn)化.而靜態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中沒(méi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及底物的刺激，一般只表達(dá)組成性酶，不會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)性酶.此外，破壁后才檢測(cè)到大量黃芩素.由此推論在轉(zhuǎn)化中起作用的酶應(yīng)屬于誘導(dǎo)酶、胞內(nèi)酶.

（2）通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)探究，得知最佳溫孵時(shí)間為96h，最佳pH為5.5，料液比為1∶100時(shí)所需菌的最佳量為4片直徑為10mm的菌餅.

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