棉花耐鹽相關序列擴增多態性(SRAP)分子標記篩選

劉雅輝， 王秀萍， 魯雪林， 張國新， 李 強

(河北省農林科學院濱海農業研究所，河北 曹妃甸 063200)

土壤鹽漬化是影響農業生產的主要脅迫因子。中國的鹽漬土近1.00×108hm2，且鹽漬化和次生鹽漬化土地面積不斷擴大［1-2］。河北省鹽漬土主要分布在沿渤海一帶的秦皇島、唐山、滄州等地，鹽漬化面積大，鹽堿程度高，土壤結構差，作物難以正常生長，嚴重影響了作物的產量和品質。因此合理開發利用鹽堿地是一項迫在眉睫的任務。棉花是中國重要的經濟作物，在國民經濟中占有舉足輕重的地位［3-4］。在糧棉爭地矛盾日益突顯的情況下，棉花以其較好的耐鹽性，逐漸成為鹽堿地一種新的優勢作物。目前，中國是世界上鹽堿地植棉規模最大的國家，據不完全統計［5］，中國植棉區內鹽堿地約有 1.67 ×107hm2，其中超過2.67×106hm2已先后開發植棉。河北省的棉花種植面積也不斷擴大，逐漸延伸到黑龍港地區和沿渤海一代的鹽堿地區域。因此，培育和推廣耐鹽棉花新品種是提高鹽堿地生產力的長久之計，也是目前鹽堿地利用的一種有效手段。耐鹽棉花品種一般需要有較強的出苗能力和抗鹽能力，這給篩選和培育耐鹽棉花品種提出了挑戰，而分子標記技術不僅為棉花耐鹽性篩選提供分子鑒定，同時也為新種質或品種的選育開辟了新的技術途徑。

植物的耐鹽性是一個及其復雜的性狀，同時受環境和植物發育時間與空間的影響。有研究發現許多植物耐鹽性狀受少數主基因控制，存在耐鹽主效基因［6-10］，因此通過尋找與耐鹽基因密切連鎖的分子標記，對于改善植物的耐鹽性是可行且十分必要的。目前，在水稻、小麥、大麥、大豆、玉米、苜蓿、結縷草等植物中，已檢測到與耐鹽相關的分子標記［11-19］，且部分已被定位和克?。?2-13，20-24］。到目前為止，有關棉花耐鹽性分子水平的研究不多，與其相關的分子標記則更少。張麗娜等［25］通過SSR標記篩選出10對區分耐鹽材料和敏鹽材料的SSR引物，初步認為采用SSR標記可以鑒定棉花耐鹽性;郭繼坤［26］采用SSR標記以魯棉97-8和蘇12為親本及184個單株的F2群體為材料，構建了一個包含8個連鎖群、25個標記的遺傳圖譜，并定位了4個控制不同生育期耐鹽性的QTLs?？梢?，篩選棉花耐鹽性分子標記是切實可行的。

本研究擬以耐鹽性差異大的兩個親本為材料利用SRAP技術和BSA法篩選與棉花耐鹽相關的分子標記，然后用其雜交組合的F2分離群體及26份耐、敏鹽品種(品系)對標記進行穩定性驗證，以期獲得與棉花耐鹽相關的分子標記，從而為棉花耐鹽種質鑒定及耐鹽棉花分子標記輔助育種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

選用耐鹽材料NY1×敏鹽材料中棉所12的F2分離群體，及26個耐、敏鹽性品種(系)作為試驗材料。26個耐(敏)鹽品種通過河北省地方標準《棉花耐鹽性鑒定評價技術規范》［27］鑒定，22個為耐鹽品種，4個敏鹽品種(表1)。

SRAP引物參照Li等［28］公布的通用引物，共組成88對引物，引物序列由北京華大基因研究中心合成。

表1 26份耐(敏)鹽棉花材料名稱、來源及耐鹽性Table 1 Names，sources and salinity tolerance of 26 cotton materials

1.2 試驗方法

1.2.1 F2群體的耐鹽性鑒定 試驗于2013年5月在河北省農林科學院濱海農業研究所現代農業科技成果轉化基地鹽堿原土鑒定池進行。在土壤全鹽含量0.1%的對照池種植30株F2，在土壤全鹽含量0.4%的處理池種植400株F2，待棉花長至1～2葉期時，隨機抽取312個單株進行耐鹽鑒定。按照河北省地方標準《棉花耐鹽性鑒定及評價技術規程》中的苗情分類標準(表2)統計耐鹽與敏鹽單株，鹽害級別為0、1、2級的植株全部記載為耐鹽，3、4級的記載為敏鹽。

1.2.2 DNA提取 利用北京康為世紀生物科技有限公司生產的 CottonGenDNAkit提取供試材料DNA，然后用北京普析通用儀器有限責任公司生產的TU-1810紫外分光光度計檢測 DNA純度與濃度。

1.2.3 DNA池的構建 從NY1×中棉所12的F2分離群體中隨機選擇耐鹽植株和敏鹽植株各20株，分別提取其基因組DNA并測定其濃度，稀釋后分別按等量混合后構建F2耐鹽池和敏鹽池。

1.2.4 PCR擴增和產物檢測 PCR反應總體系為20.0 μl，其中10 × Buffer 2.0 μl，10 mmol/L的 dNTP 0.4 μl，5 U/μl 的 Taq 酶 0.2 μl，30 ng/μl的模板DNA 1.0 μl，正反引物(50 ng/μl)各 0.7 μl，PCR染料 2.0 μl，然后加雙蒸水補齊 20.0 μl。

PCR反應在Eppendorf mastercycler gradient基因擴增儀中進行。PCR擴增程序為94℃預變性5 min;94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸10 min，進行5個循環后退火變為50℃，再進行30個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存擴增產物，在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測帶型。

表2 棉花鹽害級別分類標準Table 2 The classification of salt injury grade in cotton

2 結果與分析

2.1 棉花耐鹽SRAP分子標記的篩選

用88對SRAP引物(8個正向引物和11個反向引物組成)對2個棉花親本進行PCR擴增，篩選出清晰穩定、具有多態性條帶的引物6對。然后用這6對引物對F2群體耐、敏基因池進行擴增，篩選出1對引物(me3-em5)在耐鹽親本和耐鹽池中均能擴增出一條約為350 bp的特異片段，而在敏鹽親本和敏鹽池中未擴增出該片段(圖1)。

2.2 棉花耐鹽SRAP分子標記在F2分離群體中的鑒定

將篩選到的引物組合me3-em5對F2代中隨機選取的312株耐、敏鹽單株DNA進行擴增，進行穩定性驗證，結果(圖2)顯示，在230株耐鹽單株中有226株能擴增出此特異片段，而在82株敏鹽單株中有80株沒有擴增出該片段，2株擴增出這一片段，可以看出F2代分離群體中出現6個重組個體，重組率為1.92%。

2.3 棉花耐鹽SRAP分子標記在不同棉花品種中的鑒定

圖1 引物組合me3-em5在棉花兩親本及耐、敏池間的擴增Fig.1 Amplification of cotton parents，salt tolerant and salt sensitive pools with me3-em5

圖2 引物組合me3-em5在F2部分耐、敏鹽單株間的擴增Fig.2 Amplification of salt tolerant and salt sensitive F2plants with me3-em5

對22個耐鹽品種和4個敏鹽品種進行PCR分析，結果(圖3)顯示，22個耐鹽品種中20個品種均擴增出350 bp特異條帶，只有中棉所35和邯棉5158擴增出的條帶稍有下移接近300 bp，4個敏鹽品種中均沒有擴增出此條帶。除了中棉35和邯棉5158有細微差別外，其他品種鹽池鑒定結果與分子標記鑒定結果基本一致。

圖3 引物組合me3-em5在不同材料中的擴增Fig.3 Amplification of salt tolerant and sensitive cotton varieties with me3-em5

3 討論

棉花的耐鹽性不但受到棉花本身遺傳因素影響，還受外界環境及栽培措施的影響，其耐鹽機制至今還沒形成統一認識，很多領域尚存在爭論［29］。沈法富等［10］通過雙列雜交對6個耐鹽性不同的品種進行分析，結果表明，棉花的耐鹽性存在著加性和顯性效應，以加性效應為主，耐鹽性呈不完全顯性，受一對主效基因控制。張麗娜等［25］利用SSR技術對兩個典型的耐鹽品種和敏鹽品種進行了多態性引物篩選，初步獲得了10對引物，有望成為鑒定棉花耐鹽性的標準引物。

為了減少不同遺傳背景的影響，本研究利用SRAP標記技術和BSA法尋找棉花耐鹽相關的分子標記，共篩選了88對引物，其中有6對引物在兩親本間產生特異帶，且帶型清晰穩定，重復性較好。然后對篩選出的多態性引物在F2群體耐鹽池和敏鹽池間擴增，1對引物在耐鹽池產生350 bp大小的條帶，而在敏鹽池沒有擴增出此條帶，推測該擴增產物可能是與棉花耐鹽性連鎖的分子標記。對F2分離群體大量單株的擴增中，出現了4個重組個體，重組率為1.92%，說明該標記與耐鹽性不能共分離，但是與耐鹽性連鎖程度較為緊密。通過26個耐、敏鹽品種(品系)的驗證，證實了4個敏鹽材料中均沒有擴增出該產物，而22個耐鹽材料中基本上擴增了該產物，只是在極個別材料中發生了輕微變化，這種現象說明了在不同的材料中，標記片段的大小會發生改變，這可能是不同的遺傳背景或是不同的環境條件所致。通過研究，基本可以斷定該片段是與棉花耐鹽性狀緊密連鎖的分子標記。

由于棉花基因組序列很大，一旦獲得與耐鹽性狀緊密連鎖的標記，就證明了標記的可行性和可用性。本研究首次應用SRAP分子標記技術對棉花耐鹽性進行遺傳標記分析，最終篩選獲得1個與棉花耐鹽密切相關的SRAP分子標記，為棉花耐鹽性鑒定提供了一種快速有效的方法，從而促進棉花耐鹽性分子標記輔助育種的進程，也為棉花耐鹽基因的定位、克隆奠定良好的基礎。但是，該研究中只用了一組雜交組合及F2群體為材料，而耐鹽性是一個比較復雜的數量性狀，單一耐鹽、敏鹽親本的選擇，可能會影響到結果的準確性，未來研究應該再增加雜交組合數或建立永久的分離群體，尋找更多與耐鹽性連鎖的分子標記，以期準確定位與棉花耐鹽相關的QTL。

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