鴨Ⅰ型肝炎病毒一步法RT-LAMP可視化快速檢測方法的建立

胡 成， 朱善元， 左偉勇， 王安平， 吳 雙， 洪偉鳴， 成大榮， 馬麗麗，王永娟

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009;2.江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300;3.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州730070)

鴨 I型肝炎病毒(Duck hepatitis virus type I，DHV I)是一種高致死性、高傳播性的病毒性傳染病病原［1］。該病毒傳播迅速，主要侵害4周齡以內的雛鴨。病雛鴨的特征為意識紊亂，急性肝炎，肝臟腫大，有出血斑點［2-3］。在新疫區，本病的死亡率很高，可達90%以上，是危害養鴨業發展最為嚴重的傳染病之一［4］。

DHV I的傳統檢測方法有血清中和試驗、瓊脂擴散試驗和酶聯免疫吸附試驗等，這些檢測方法雖然可以對病原做出診斷，但是存在靈敏性不高，試驗時間長，重復性低，不易標準化等缺點，在實際應用中有一定的局限性［5-7］。目前，已建立的RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測方法，雖然靈敏性相對較高，但是需要使用昂貴的儀器和試劑，專業的人員，試驗周期較長，不能適應基層獸醫站和養殖場簡便易行快速檢測的需要［8-9］。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是2000年由日本榮研化學株式會社開發的一種新型的恒溫核酸擴增方法［10］。該技術依賴于能夠識別靶序列上特異區域的引物和一種具有解旋功能的Bst DNA聚合酶，能夠在等溫條件下，短時間內實現核酸的指數級擴增［11］。以其簡單、快速、高效、靈敏、特異等諸多優點［12-14］受到越來越多獸醫工作者的關注。在一些病原微生物的檢測中已經開始得到推廣應用［15-18］。目前，國內尚無針對鴨I型肝炎病毒的一步法快速RT-LAMP檢測方法。因此本研究設計了一套特異性引物，擬建立了DHV I的可視化檢測方法，為研制DHV I的快速檢測試劑盒打下基礎。

1 材料和方法

1.1 病毒株

鴨I型肝炎病毒(DHV I AV2111)購自中國獸醫藥品監察所;新城疫病毒(NDV)、番鴨細小病毒(MDPV)、小鵝瘟病毒(GPV)和鴨瘟病毒(DPV)株均由本實驗室分離、鑒定并于-80℃保存。

1.2 試劑及器材

MgSO4、Bst DNA 聚合酶(大片段)、Betaine和SYBR Green I染料購自New England Biolabs公司;RT-PCR檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;病毒基因組提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;限制性內切酶 SphI、DNA marker購自TaKaRa公司;dNTP、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DEPC水購自Sigma公司;其他試劑均為市售分析純。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中登錄的多條DHV I的基因序列，選取一段高度保守的區域(VP1蛋白基因序列:EF442073.1)，使用在線引物設計軟件Primer Explorer V4設計多套LAMP引物，其中包括2條外引物F3和B3;2條內引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2);2條環引物LF和LB，分別識別保守區域8個基因位點。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成(表1)。

表1 LAMP引物序列Table 1 Sequences of LAMP primers

1.4 病毒核酸的提取

參照生工柱式病毒抽提純化試劑盒說明書及相關文獻記載［19］，分別提取鴨I型肝炎病毒、新城疫病毒、番鴨細小病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的基因組，取1 μl樣品利用分光光度儀測定病毒總含量，少量分裝，于-80℃保存備用。

1.5 RT-LAMP反應體系的建立及優化

1.5.1 鎂離子濃度的優化 鎂離子終濃度為3.5～6.0 mmol/L，以0.5 mmol/L梯度依次遞增，重復進行3次平行反應。

1.5.2 引物濃度的優化 由于外引物對試驗結果影響很小，所以試驗中參照文獻數據固定外引物，對內引物終濃度為 0.8 ～ 2.4 μmol/L，以 0.4 μmol/L梯度依次遞增，重復進行3次平行反應。

1.5.3 dNTPs濃度的優化 dNTPs終濃度為0.8～1.8 mmol/L，以0.2 mmol/L梯度依次遞增，重復進行3次平行反應。

1.5.4 甜菜堿濃度的優化 由于甜菜堿具有穩定酶活性的作用，同時又可以增強反應的特異性，甜菜堿終濃度為0.2～0.7 mol/L，以0.1 mol/L梯度依次遞增，重復進行3次平行反應。

1.5.5 反應溫度的優化 以DHV AV2111 RNA為模板，反應溫度為61～66℃，以1℃梯度依次遞增，重復進行3次平行反應。

1.5.6 最佳反應時間的確定 反應時間為15～90 min，以15 mim梯度依次遞增，重復進行3次平行反應。

1.5.7 擴增產物的檢測 反應結束后肉眼直接觀察反應管是否有混濁(短暫離心后可使焦磷酸鎂沉于管底，更利于觀察);吸取10 μl反應液于1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察;向剩余15 μl反應液中加入0.5 μl SYBR Green I染料輔助觀察。

1.5.8 擴增產物的酶切鑒定 用SeqBilder軟件分析RT-LAMP目的片段中的酶切位點，并篩選出單一的SphI(位點GCATG/C)限制性內切酶。20 μl酶切體系如下:SphI(10U)1 μl，10 × 緩沖液 H 2 μl，RT-LAMP產物 5 μl，超純水 12 μl ，37 ℃ 反應 2 h。取10 μl的酶切產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.6 RT-PCR方法的建立

參照一步法RT-PCR檢測試劑盒說明書。加入引物F3和 B3及模板 RNA各1 μl。反應體系為25 μl，于PCR儀上按如下程序進行擴增:45℃孵育45 min;94℃預變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環;72℃延伸7 min。

1.7 RT-LAMP的靈敏性檢驗

將抽提的DHV I核酸模板進行10倍系列稀釋成 10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl等 8 個濃度梯度。對各濃度RNA模板分別用所建立的RT-LAMP和RT-PCR檢測方法進行靈敏性對比試驗。

1.8 RT-LAMP的特異性試驗

分別用抽提的鴨I型肝炎病毒、新城疫病毒、番鴨細小病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒基因組，按照所建立的鴨I型肝炎病毒RT-LAMP檢測方法，進行特異性試驗。

1.9 RT-LAMP重復性和穩定性試驗

取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，分別提取RNA進行RT-LAMP檢測，觀察結果。取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，對每一代次重復3次進行RT-LAMP檢測，觀察結果，以確定該檢測方法的重復性和穩定性。

2 結果與分析

2.1 RT-LAMP反應條件

通過對各反應條件的調整優化，最終確定RT-LAMP反應體系為25 μl:包括Bst DNA聚合酶(8 U/μl)1.0 μl、10 × Bst Buffer 2.5 μl、dNTPs(10 mmol/L)3.5 μl、Betaine(5 mol/L)2.0 μl、MgSO4(25 mmol/L)4.0 μl、AMV(5 U/μl)1.0 μl、Inhibitor(40 U/μl)1.0 μl、FIP/BIP(20 μmol/L)2.0 μl、F3/B3(20 μmol/L)0.5 μl、LF/LB(20 μmol/L)0.2 μl、模板 RNA 1.0 μl，加 DEPC 水補足至 25 μl。充分混勻。反應程序:63℃反應45 min，85℃滅活5 min。

2.2 最佳反應時間

在反應進行45 min后，電泳檢測有明顯的條帶，且隨著時間延長，條帶亮度并沒有顯著增強，因此選擇45 min為最佳反應時間(圖1)。

2.3 特異性

2.3.1 產物酶切鑒定 用限制性內切酶SphI對RT-LAMP產物進行酶切鑒定，出現與預期大小218 bp相符合的酶切產物條帶(圖2)。

2.3.2 特異性檢驗 采用本試驗建立的RT-LAMP方法進行檢測，只有以DHV AV2111的RNA為模板時，結果為陽性(肉眼觀察反應管可見乳白色渾濁，加入SYBR Green I染料后呈現翠綠色，1.5%瓊脂糖凝膠電泳呈現特異性梯形條帶)，而以新城疫病毒、番鴨細小病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的DNA/RNA為模板進行檢測時，結果均為陰性(肉眼觀察反應管清亮透明、無乳白色渾濁，加入SYBR Green I染料后呈現橘紅色，1.5%瓊脂糖凝膠電泳無特異性梯形條帶出現)(圖3)，表明該方法的特異性良好。

圖1 最佳反應時間的確定Fig.1 Determination of the best reaction time

圖2 DHVⅠRT-LAMP擴增產物酶切鑒定Fig.2 Results of the specificity of DHVⅠRT-LAMP assay

2.4 靈敏性

所建立的RT-LAMP對DHV RNA的最低檢測限為10 fg(圖4)，而常規RT-PCR方法最低檢測限為1 pg(圖5)，建立的 RT-LAMP敏感性比常規RT-PCR高約100倍。

圖3 RT-LAMP方法檢測DHVⅠ的特異性Fig.3 Specificity of RT-LAMP assay for DHVⅠ

圖4 RT-LAMP方法檢測DHVⅠ的靈敏性Fig.4 Sensitivity of RT-LAMP assay for DHVⅠ

圖5 RT-PCR方法檢測DHVⅠ的靈敏性Fig.5 Sensitivity of RT-PCR assay for DHVⅠ

2.5 重復性和穩定性

取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，分別提取RNA進行RT-LAMP檢測，結果顯示，5份檢測結果均沒有明顯差異;取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，對每一代次重復三次進行RT-LAMP檢測，結果顯示，3次重復間沒有明顯差異。

3 討論

鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV)引起的雛鴨的一種具有高度傳播性、高度致死性傳染病。DHV分為I型、II型和III型，三個型之間無交叉保護作用。I型DHV呈現世界性分布，并常和其他病毒、細菌混合感染，對養鴨業危害嚴重，造成了巨大的經濟損失［20-21］。本研究建立的DHV I檢測方法對基層和臨床快速診斷和疾病處置具有一定的指導意義。

LAMP技術是一種新型核酸擴增技術。與其他檢測方法相比，該方法具有特異性強，靈敏度高，擴增高效、快速，步驟簡單等諸多優點。該技術主要利用了Bst DNA聚合酶在特異性引物的存在下于61～66℃具有解旋功能和瀑布式擴增功能，在等溫的情況下即可實現核酸的變性與擴增。LAMP的關鍵點是引物設計和評估，需要設計出針對基因保守片段的6條引物且識別8個特異性的位點。常規的LAMP只需要 F3、B3和 FIP(F1c+F2)、BIP(B1c+B2)即可實現目的基因的擴增［22-24］。但是為了提高反應效率，加快檢測速度，本研究在F1c+F2之間增加了LF引物，在B1c+B2之間增加了LB引物，大大提高了LAMP的反應速度，在30～45 min即可實現目的基因的擴增檢測。

本研究分別利用肉眼顏色觀察和瓊脂糖凝膠電泳的檢測方法對DHV I RT-LAMP反應引物、體系進行檢測和分析，得到了高效、特異性擴增DHV I的RT-LAMP引物，最佳的反應體系配比和最短有效反應時間，建立了可視化的檢測DHV I的RT-LAMP方法，只有鴨I型肝炎陽性樣本能進行核酸的特異性擴增，其他常見家禽病原均不發生非特異性反應;DHV I核酸在該體系中63℃孵育45 min，即可判斷結果，比目前的PCR方法更為便捷，且檢出限量達到10 fg，顯示出極高的靈敏性。

本試驗將肉眼沉淀觀察法、染料輔助觀察法相結合，并分別與瓊脂糖凝膠電泳法對比:其中肉眼沉淀觀察法在反應產物較少時存在假陰性的可能，而SYBR Green I染料輔助觀察法與瓊脂糖凝膠電泳結果高度一致，說明SYBR Green I染料輔助觀察法可作為一種檢測方法，這樣不僅省去了傳統的瓊脂糖凝膠電泳的過程，節省了時間和費用，同時也保護了環境和操作人員，更加方便基層和現場快速檢測。

本試驗建立的DHV I RT-LAMP檢測方法簡便、快速、靈敏、特異，具有較高的實用性，適合在基層獸醫站和養殖場推廣使用，為DHV I的綜合防治和早期診斷提供了便利。

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