液相色譜－串聯質譜法同時測定葡萄酒中6種吡唑類殺菌劑

陳祥準，夏碧琪，黃芙珍，程 潔，沈 燕，韓 超*

(1．溫州出入境檢驗檢疫局，浙江 溫州 325027;2．溫州大學 化學與材料工程學院，浙江 溫州 325035)

殺菌劑是用于防治由各種病原微生物引起的植物病害的一類低毒農藥。吡唑類化合物具有高效、低毒以及吡唑環上取代基可多方位變換等優勢和多種生物活性，是新型殺菌劑開發的熱點之一［1］。近年來，多種吡唑類殺菌劑被越來越廣泛地應用于農業生產中的植物病害控制，如谷物、蔬菜和水果等。許多國家和組織對其在植物源性食品中的限量已出臺了相關規定，如歐盟規定葡萄酒中氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、聯苯吡菌胺的最高殘留量(MRLs)為0.01 mg·kg－1［2］。因此，建立準確、可靠的測定葡萄酒中吡唑類殺菌劑殘留量的方法非常重要。

目前，關于食品和環境中殺菌劑檢測的研究［3－16］已有報道，但對葡萄酒中吡唑類殺菌劑的檢測方法研究較少，且未見同時測定葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯苯吡菌胺、呋吡菌胺殘留量的報道。本文結合固相萃取和液相色譜－串聯質譜法進行分析，建立了同時測定葡萄酒中上述6種吡唑類殺菌劑的分析方法，該方法具有前處理簡單、靈敏度高、結果準確等優點，可用于實際樣品的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、API 4000三重四極桿質譜儀(美國AB應用生物系統公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);Elma P300 H超聲波清洗器(德國Elma公司)，甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司);甲酸(純度≥99%)、乙酸(純度100%)、甲酸銨(純度≥99%)、乙酸銨(純度≥97%)(美國Alfa Aesar公司);MCX SPE強陽離子交換固相萃取柱(Waters公司，60 mg/3 mL);MAX SPE強陰離子交換固相萃取柱(Waters公司，60 mg/3 mL);HLB SPE強陽離子交換固相萃取柱(Waters公司，60 mg/3 mL);ENVI C18交換柱固相萃取柱(Superclean，60 mg/3 mL);其它試劑均為分析純。實驗用葡萄酒為附近超市或企業送檢樣品。呋吡菌胺(純度≥99.9%)、吡咪唑(純度≥99.0%)、氟唑菌酰胺(純度≥99.7%)、聯苯吡菌胺(純度≥98.5%)均購自Dr．Ehrenstorfer GmbH，戊苯吡菌胺(純度≥98.4%)、吡唑萘菌胺(純度≥99.7%)購自Sigma－Aldrich公司;上述6種吡唑類殺菌劑標準品用甲醇配制成質量濃度為500 mg·L－1的儲備液;使用時，以甲醇稀釋上述標準儲備液，配制成1 000 μg·L－1的混合標準工作溶液。基質校準工作溶液制備:分別稱取5.0 g空白葡萄酒樣品5份，按照“1.3”方法進行樣品處理，氮吹至約0.5 mL，依次加入5，10，25，50，250 μL的混合標準工作溶液，再用甲醇定容至5 mL，即得濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，50.0 μg·L－1的基質校準工作溶液。

1.2 色譜－質譜條件

1.2.1 液相色譜條件 Agilent ZOBRAX C18(2.1 mm×150 mm，5 μm);流動相:A為0.1%乙酸的水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～4 min，50%～90%B，保持11 min;流速:250 μL·min－1;進樣量為10 μL，柱溫30℃。

1.2.2 質譜條件 電噴霧離子源:負離子掃描;離子源溫度500℃;電噴霧電壓5 000 V;霧化氣(GS1)壓力344.5 kPa;輔助氣流速(GS2)275.6 kPa;氣簾氣壓力68.9 kPa;碰撞氣(CAD)壓力137.8 kPa。監測模式:多反應監測(MRM)。

1.3 樣品處理與凈化

1.3.1 提 取 稱取葡萄酒樣品5.0 g，加入3 mL超純水混勻得到待檢液。

1.3.2 凈 化 HLB SPE柱依次用甲醇和水活化，取全部待檢液至SPE柱，待樣品溶液全部流出后，再依次用6 mL水和6 mL甲醇－水混合溶液(2∶3)淋洗，真空抽干，用6 mL甲醇洗脫，洗脫液40℃氮氣吹干，用2 mL甲醇溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后，供LC－MS/MS測定。

2 結果與討論

2.1 凈化條件的優化

葡萄酒的成分復雜，含有多種花色素和酚類等干擾物質［17－18］，本研究將樣品直接加水稀釋，考慮到葡萄酒樣品中的大量基質雜質可能會影響待測物的定性和定量分析結果，故需要對提取液進行凈化處理。實驗采用SPE固相萃取柱凈化提取液。

2.1.1 SPE柱的選擇 分別對葡萄酒加標濃度為1.0 μg·kg－1的6種吡唑類殺菌劑進行回收率實驗，考察了不同SPE柱(Waters Oasis HLB、Waters Oasis MCX、Waters Oasis MAX和Superclean ENVI C18)的凈化回收率。重復測定3次，計算方法的平均回收率。結果表明，MCX、MAX和C18柱的回收率為65.6%～81.5%，而HLB柱的凈化效果相對較好，回收率為72.8%～92.6%，可滿足檢測要求。因此實驗采用Waters Oasis HLB柱進行凈化處理。

2.1.2 淋洗液的選擇 考察了甲醇－水淋洗液配比(20%，30%，40%，50%)對萃取回收率的影響，結果發現40%甲醇水溶液凈化的回收率(82.4%～93.5%)與20%(回收率為81.4%～92.1%)以及30%(回收率為82.0%～92.4%)甲醇水溶液凈化的回收率相差不大，且不會將6種吡唑類殺菌劑洗脫下來。而50%甲醇水溶液會將部分吡唑類殺菌劑淋洗下來(回收率為38.5%～57.1%)，對回收率有較大影響。考慮到甲醇含量高時，可以淋洗掉更多的雜質，減少對儀器的污染，因此實驗采用40%甲醇水溶液為淋洗液。隨后采用6 mL純甲醇作為洗脫液洗脫待測化合物。

2.2 質譜條件的優化

將200 ng·mL－1的6種吡唑類殺菌劑標準溶液在ESI源正離子和負離子模式下進行全掃描，以選擇適當的定性、定量離子和電離方式。結果表明:在ESI源的負離子模式下，6種殺菌劑均呈現出最佳響應，準分子離子［M－H］－是響應強度最高的離子。確定母離子后，在MRM模式下通過優化碰撞能量、透鏡電壓等質譜參數，使各分析化合物的響應最大化。質譜參數及母離子和子離子詳見表1。

表1 化合物的多反應監測質譜參數Table 1 Optimized MRM parameters for the determination of compounds

2.3 色譜條件的優化

考察了不同色譜柱(ZORBAX Eclipse Plus C18，Waters X BridgeTMC18，Waters XselectTMHSS T3)對6種吡唑類殺菌劑分離效果和靈敏度的影響。結果表明，使用 Agilent ZOBRAX C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)色譜柱時分離效果最佳。分別考察了以甲醇－水和乙腈－水為流動相，以及在流動相中分別添加0.05%和0.1%的甲酸、乙酸，10 mmol/L的甲酸銨、乙酸銨等物質時對目標物色譜行為和離子化程度的影響。結果發現，有機相為乙腈時的分離效果優于甲醇;在加入甲酸溶液后，負離子的形成受到抑制，而0.1%乙酸水溶液－乙腈體系的靈敏度優于甲酸銨－乙腈和乙酸銨－乙腈體系，故實驗選擇0.1%乙酸水溶液－乙腈為流動相，以獲得較好的色譜峰形。其總離子流圖見圖1A。

2.4 方法評價

圖1 6種吡唑類殺菌劑標準溶液(1.0 ng·mL－1，A)及空白葡萄酒中添加6種殺菌劑(0.4 μg·kg－1，B)的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of six pyrazole fungicides(1.0 ng·mL－1，A)and a grape wine sample spiked with six pyrazole fungicides(0.4 μg·kg－1，B)

本方法采用基質匹配標準溶液進行校正補償，以減少基質效應對6種殺菌劑檢測結果的干擾。在優化條件下，考察了6種待測物的線性范圍，結果顯示，6種待測物的質量濃度(X，μg·L－1)均在 1.0 ～50.0 μg·L－1范圍內與其峰面積(Y，Counts)具有良好的線性關系，相關系數(r2)均不低于0.999 3。以10倍信噪比(S/N)計算方法定量下限(LOQ)為 0.1 ～0.4 μg·kg－1(表 2)。與目前歐盟對葡萄酒中3種殺菌劑的最大殘留限量(0.01 mg·kg－1)［2］要求相比，本方法完全滿足這6種殺菌劑的檢測要求。

在低、中、高3個加標水平下對同一空白葡萄酒樣品進行3次平行實驗，回收率與相對標準偏差(RSD)列于表2。由表2可知，各化合物的平均回收率為72.8%～92.6%，RSD不大于6.7%，本方法的準確度和精密度均符合農藥殘留分析的要求。圖1B為空白葡萄酒樣品中添加6種殺菌劑(0.4 μg·kg－1)后的總離子流色譜圖。

表2 6種吡唑類殺菌劑的線性關系、定量下限、回收率及相對標準偏差(n=3)Table 2 Regression relationships，limits of quantitation(LOQ)，recoveries and RSDs of six pyrazole fungicides(n=3)

2.5 實際樣品的測定

采用本文建立的方法，對實驗室受理的50種進口葡萄酒進行6種吡唑類殺菌劑殘留檢測，結果均未檢出上述6種殺菌劑。

3 結論

本文建立了液相色譜－串聯質譜技術同時測定葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯苯吡菌胺、呋吡菌胺的分析方法，該方法前處理簡單，靈敏度高，定性、定量準確，滿足國際上對葡萄酒中吡唑類殺菌劑MRLs的要求，可用于葡萄酒中這6種殺菌劑的日常測定和確證工作。

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