復合菌生物轉化白酒糟發酵條件的優化

焦肖飛，劉建學*，韓四海，李 璇，李佩艷，羅登林，張衛衛，徐寶成

復合菌生物轉化白酒糟發酵條件的優化

焦肖飛，劉建學*，韓四海，李 璇，李佩艷，羅登林，張衛衛，徐寶成

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

以未發酵白酒糟培養基為對照組，探討不同菌種組合以及發酵條件對固態發酵白酒糟中蛋白含量的影響，旨在提高酒糟中真蛋白的含量。選用枯草芽孢桿菌、白地霉和產朊假絲酵母對白酒糟進行單菌和復合菌發酵實驗，結果顯示三菌組合發酵效果最好。通過三菌單因素發酵試驗及正交試驗確定最佳發酵條件為：添加15%的麩皮和2%的尿素，先接種5%的枯草芽孢桿菌和10%的白地霉30℃培養24 h，然后接種5%的產朊假絲酵母30℃培養72 h，此時真蛋白的含量為24.85%，粗蛋白含量達32.09%，粗纖維含量降低到17.66%。

白酒糟；復合菌發酵；真蛋白；條件優化

酒糟是釀酒制造業所產生的主要廢棄物，據報道，2013年上半年產生了2 000萬余噸的白酒糟[1]，經過晾曬去除多余水分后，干白酒糟年產量達到400萬t以上[2]。目前對酒糟的研究主要包括以下方面：從酒糟中提取纖維素[3]、植酸[4]、氨基酸[5]和蛋白質[6]等；利用酒糟培養多種食用菌（如靈芝[7]、雞腿菇[8]、秀珍菇[9]、雙孢菇[10]等）；利用酒糟制取甘油[11]；利用酒糟釀醋[12]；利用酒糟厭氧發酵回收沼氣[13]；利用酒糟發酵生產燃料乙醇[14]；生產酶制劑[15]；生產飼料[16-18]。

鮮白酒糟因其產量大、不易貯藏與運輸，目前主要是做廢棄物處理或經晾曬后用作粗飼料，但由于價格低廉，經濟效益不夠明顯，造成了資源的巨大浪費和對周圍環境的嚴重污染。而酒糟蛋白的提取是酒糟綜合利用及深加工的重要途徑，提取的蛋白質可以加工成多種高蛋白的食品，作為調味品和保健品基料應用到食品工業中[19]，具有顯著的經濟效益和社會效益，且植物蛋白相對于動物蛋白，具有良好的消化率和動物蛋白無法比擬的功能，如降低膽固醇水平、減少癌癥的發生、改善心血管疾病的癥狀等[20]。

由于單菌種對酒糟蛋白質的提高有限，本實驗選用生育周期短、繁殖能力強、生產條件不嚴，能分泌多種酶系，具有降解淀粉、纖維素和半纖維素能力的枯草芽孢桿菌，能同化多種有機氮源和尿素并可利用木聚糖、纖維素等大分子難降解物質，而且能有效轉化殘糖、有機酸、脂肪酸 等物質的白地霉[21]，以及能大量繁殖、蛋白質可利用率高[22]，且無毒副作用的產朊假絲酵母作為發酵菌種，利用多菌株間的協同作用，對白酒糟進行固態協同發酵轉化，更能充分利用酒糟的碳源、氮源，使發酵產物中的蛋白含量明顯提高，尤其是真蛋白含量，為白酒糟開發食品蛋白質提供依據。該產品原料來源豐富、生產成本低，具有良好的發展前景。

1 材料與方法

1.1材料、菌種、培養基與試劑

白酒糟由河南省伊川杜康酒廠提供，含水量為65%～70%，烘干保存備用；麩皮購于當地。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B）由河南科技大學食品與生物工程學院實驗室提供；白地霉（Geotrichum candidum，G）購自江南大學；產朊假絲酵母（Candida utilis，C）由河南省科學院生物研究所提供。

LB培養基：121℃條件下滅菌20 min；PDA培養基：115℃條件下滅菌20 min；YPD培養基：115℃條件下滅菌20 min；基本固態發酵培養基：取白酒糟13.5 g（90份，以干質量計）、加蒸餾水19.5 mL（130份）、麩皮1.5 g（10份）、尿素0.3 g（2份）充分混合后，在121℃條件下滅菌處理30 min，冷卻后備用。所用試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

FA1004萬分之一天平 上海上平儀器有限公司；101-2型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-SⅡ高壓蒸汽滅菌鍋、SX2-4-10高溫箱電阻爐 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1D型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DH-500電熱恒溫培養箱 北京中興偉業儀器有限公司；HQY-C氣浴恒溫振蕩器 金壇市宏科儀器廠；CXC-06粗纖維測定儀 上海新嘉有限公司；100～1 000μL移液槍 上海恒奇儀器儀表有限公司；老本行150T多功能粉碎機 鉑歐五金廠。

1.3方法

1.3.1菌種的活化

無菌操作下挑取枯草芽孢桿菌一環，接種于LB斜面培養基上，37℃條件下培養24 h；挑取白地霉一環，接種于PDA斜面培養基上，30℃條件下培養24 h；挑取產朊假絲酵母一環，接種于YPD斜面培養基上，30℃條件下培養24 h。為保證存活效果，3種菌種至少各培養3管。

1.3.2菌種的擴大培養

枯草芽孢桿菌的擴大培養：配制LB液體培養基，分裝100 mL于250 mL三角瓶中，121℃條件下滅菌20 min后冷卻，接種枯草芽孢桿菌活化菌，在37℃、150 r/min條件下搖床培養24 h；白地霉的擴大培養：配制PDA液體培養基，分裝100 mL于250 mL三角瓶中，115℃條件下滅菌20 min后冷卻，接種白地霉活化菌，在28℃、150 r/min條件下搖床培養24 h；產朊假絲酵母的擴大培養：配制YPD液體培養基，分裝100 mL于250 mL三角瓶中，115℃條件下滅菌20 min后冷卻，接種產朊假絲酵母活化菌，在28℃、150 r/min條件下搖床培養24 h。

1.3.3平板點種實驗

取基本固態發酵培養基于三角瓶中，加150 mL蒸餾水浸泡48 h，取100 mL浸提液，加2 g瓊脂，121℃條件下滅菌20 min，倒平板。無菌操作分別點種：枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、白地霉，30℃條件下恒溫培養24 h，觀察菌落生長情況。

1.3.4拮抗實驗

將枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、白地霉3種菌，兩兩交叉劃線接種于普通營養瓊脂培養基上，30℃條件下培養24 h，觀察十字交叉處是否有被抑制而發生菌落萎縮和消失的現象。

1.3.5單菌種發酵實驗

取基本固態發酵培養基，分別按15 mL/100 g的接種量接入單菌種，于30℃條件下恒溫培養箱中培養72 h。

1.3.6混菌發酵實驗

取基本固態發酵培養基，將三菌兩兩組合，按15 mL/100 g的總接種量分別接入雙菌組合（接種比例為1∶1）和三菌（接種比例為1∶1∶1）混合發酵，于30℃條件下恒溫培養箱中培養72 h。

1.3.7三菌發酵單因素試驗

接種方式：在m（酒糟）∶m（麩皮）=9∶1（麩皮添加量為10%），接種總量為15 mL/100 g（白地霉（G）∶枯草芽孢桿菌（B）∶產朊假絲酵母（C）=1∶1∶1），尿素添加量為2%的條件下，將其接種方式設定為同時接種B+C+G發酵72 h（Ⅰ組）；先接種B發酵24 h，再接種C+G發酵72 h（Ⅱ組）；先接種G發酵24 h，再接種B+C發酵72 h（Ⅲ組）；先接種B+G發酵24 h，再接種C發酵72 h（Ⅳ組）；同時接種B+C+G發酵96 h（Ⅴ組）。發酵結束后測定其粗蛋白、真蛋白和粗纖維含量。

接種量：在m（酒糟）∶m（麩皮）=9∶1（麩皮添加量為10%），尿素添加量為2%，先接種B+G發酵24 h，再接種C發酵72 h的條件下，將G+B+C混合接種量（mL/100 g）設定為5+5+10、5+10+10、5+5+5、5+10+5、10+5+5。發酵結束后測定其粗蛋白、真蛋白和粗纖維含量。

尿素添加量：在m（酒糟）∶m（麩皮）=9∶1（麩皮添加量為10%），尿素添加量為2%，先接種10 mL/100 g白地霉和5 mL/100 g枯草芽孢桿菌發酵24 h，再接種5 mL/100 g產朊假絲酵母發酵72 h的條件下，將尿素添加量設定為1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%，發酵結束后測定其粗蛋白、真蛋白和粗纖維含量。

麩皮添加量：在尿素添加量為2.5%，先接種10 mL/100 g白地霉和5 mL/100 g枯草芽孢桿菌發酵24 h，再接種5 mL/100 g產朊假絲酵母發酵72 h的條件下，將麩皮的添加量設定為5%、10%、15%、20%、25%，發酵結束后測定其粗蛋白、真蛋白和粗纖維含量。

1.3.8正交試驗

以接種方式、接種量（G+B+C）、尿素添加量和麩皮的添加量為變量，以真蛋白含量為指標，進行L16（44）正交試驗，確定最佳發酵條件。

1.3.9測定方法

粗蛋白含量測定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法。

真蛋白含量的測定[23]：稱取0.5 g樣品，置于250 mL燒杯中，加蒸餾水50 mL，電爐加熱煮沸，加入10%CuSO4·5H2O 20 mL，在攪拌下加2.5%NaOH 20 mL，搖勻，室溫放置2 h，沉淀物用中性快速定性濾紙過濾，并用煮開的蒸餾水洗滌燒杯和沉淀物數次，直至洗出液無硫酸根離子（用10%BaSO4溶液檢驗），最后連同濾紙一起于80℃烘箱中烘至略潮，移入凱氏燒瓶中，消化后用凱氏定氮法測定樣品中真蛋白含量，同時作空白對照（對應加入一塊濾紙消化）。

粗纖維含量的測定：粗纖維測定儀。

2 結果與分析

2.1 3種菌在基本固態發酵培養基上的生長情況

圖1 3 種菌在基本固態發酵培養基上的生長Fig.1 Growth status of Bacillus subtilis, Candida utilis and Geotrichum candidum on solid basal medium

如圖1所示，培養基上3種菌落均能良好生長，說明基本固態發酵培養基能滿足枯草芽孢桿菌、白地霉和產朊假絲酵母的生長需求，可以選擇其為發酵菌種。

2.2拮抗實驗

圖2 3 種菌的拮抗實驗結果Fig.2 Antagonism of Bacillus subtilis, Candida utilis and Geotrichum candidum

如圖2所示，平板上3種菌均生長良好，兩兩交叉處無菌落萎縮或消失現象，說明3種菌之間沒有拮抗作用，可以用于混菌發酵實驗。

2.3單菌種發酵和混菌發酵研究

圖3 不同單菌種對發酵效果的影響Fig.3 Influence of different pure cultures on the contents of true protein, crude protein and crude fiber

由圖3可知，枯草芽孢桿菌和白地霉具有較好的降解纖維素的能力，與空白對照組相比，分別降低了4.22%和3.90%，白地霉和產朊假絲酵母具有較好的轉化蛋白的能力，真蛋白含量分別提高了9.52%和9.60%。三菌發酵效果最好，粗蛋白含量可以達到28.95%，真蛋白含量可以達到22.63%，粗纖維含量降低為19.96%。

2.4三菌發酵條件優化

2.4.1接種方式對發酵效果的影響

表1 不同接種方式對發酵效果的影響Table1 Influence of different inoculation methods on the contents of true protein, crude protein and crude fiber

由表1可知，當先接種白地霉和枯草芽孢桿菌發酵24 h，再接種產朊假絲酵母發酵72 h時（Ⅳ組），粗蛋白含量和真蛋白含量最高，分別為29.78%和23.01%，粗纖維含量最低，為18.57%。這可能是因為菌種的生長周期不完全相同，產酶種類對菌種間的協同作用有影響，當先接種白地霉和枯草芽孢桿菌時，能降解一部分粗纖維，并分解淀粉為單糖，24 h后接種產朊假絲酵母，酵母能利用已被分解的單糖和小分子物質合成蛋白，從而提高發酵產物中的蛋白含量。

2.4.2接種量對發酵效果的影響

微生物在生長過程中要經歷遲緩期、對數生長期、穩定生長期和衰亡期，遲緩期的存在會延長微生物正常的生長周期，所以應盡量縮短遲緩期，而適當增大接種量可以縮短、甚至消除遲緩期[24]。由表2可知，隨著總接種量的增加，發酵產物的真蛋白質含量先升高后降低，當白地霉的接種量為10 mL/100 g，枯草芽孢桿菌的接種量為5 mL/100 g，產朊假絲酵母的接種量為5 mL/100 g時，粗蛋白含量和真蛋白含量最高，分別為30.53%和23.47%，粗纖維含量最低，為18.18%。但是接種量過多時，會使菌種間競爭性的利用營養物質，反而不利于菌種的生長發酵，會影響發酵效果，當總接種量為25 mL/100 g時，粗蛋白和真蛋白的含量分別為29.18%和22.84%，粗纖維的含量為18.38%。

表2 不同接種量對發酵效果的影響Table2 Influence of different inoculum sizes on the contents of true protein, crude protein and crude fiber

2.4.3尿素添加量對發酵效果的影響

圖4 不同尿素添加量對發酵效果的影響Fig.4 Influence of urea concentration on the contents of true protein, crude protein and crude fiber

由圖4可知，添加尿素能提高發酵產物蛋白質含量，隨著尿素添加量的增加，粗蛋白含量增加；當尿素添加量為2.5%時，真蛋白含量最高，達到24.15%，粗蛋白含量為31.32%，粗纖維含量最低，為17.97%。當氮源添加量低于2.5%時，不能滿足混菌生長的需要，菌體生長緩慢，發酵產物的蛋白含量降低，尿素添加量1.5%時，粗蛋白和真蛋白的含量分別為29.65%和23.06%，粗纖維含量為18.73%；當氮源添加量高于2.5%時，微生物對外加氮源的利用能力有限，不能將過量的無機氮源轉化為菌體蛋白，尿素添加量3.5%時，粗蛋白和真蛋白含量分別為31.14%和23.51%，粗纖維含量為18.29%。

2.4.4麩皮添加量對發酵效果的影響

微生物在生長代謝過程中需要吸收各種有機碳水化合物構建新的細胞組分，所以添加適量的碳源可以促進菌體的生長代謝，有效提高發酵產物的蛋白含量，但是碳源過高反而會抑制微生物的生長。由圖5可知，當麩皮的添加量小于15%時，隨著麩皮的添加量增多，蛋白含量呈增長趨勢。5%的麩皮添加量時，粗蛋白和真蛋白的含量分別為29.26%和22.69%，粗纖維的含量為18.44%；當酒糟的添加量為85%，麩皮的添加量為15%時，粗蛋白含量和真蛋白含量最高，分別為32.15%和24.92%，粗纖維含量最低，為17.62%。當麩皮的添加量大于15%時，隨著麩皮的添加量增多，蛋白含量呈降低趨勢。25%的麩皮添加量時，粗蛋白和真蛋白的含量分別為31.03%和24.17%，粗纖維的含量為17.89%。

圖5 不同麩皮添加量對發酵效果的影響Fig.5 Influence of wheat bran concentration on the contents of true protein, crude protein and crude fiber

2.4.5正交試驗結果

表3 正交試驗結果Table3 Results of orthogonal array experiments

表4 正交試驗設計方差分析Table4 Analysis of variance of the orthogonal designTab

由表3可知，影響真蛋白含量的主次因素為A＞D＞B＞C，最佳條件組合為A4B4C3D2。且由因素C的K2和K3可以看出兩水平結果較為相近。因為正交試驗中沒有進行A4B4C3D2組試驗，為了確定其準確性，在此條件下做驗證實驗，測得發酵產物真蛋白的含量為24.93%。且A4B4C2D2試驗組測得的發酵產物真蛋白的含量為24.85%，與24.93%相差不大，粗蛋白含量達32.09%，粗纖維含量降低到17.66%。綜合考慮成本原因，最終選擇A4B4C2D2組為最佳試驗組。由方差分析得到4個因素對發酵產物中真蛋白含量的提高均有顯著影響。

3 結 論

枯草芽孢桿菌、白地酶和產朊假絲酵母3種菌作為蛋白轉化菌來生產飼料用蛋白或食品中間物，因其不產生毒素而安全可靠。

對固態發酵過程中提取蛋白的影響因素進行了研究。結果表明接種方式、接種量、尿素添加量、麩皮添加量對發酵產物中的真蛋白均有顯著性影響，影響因素主次為接種方式＞麩皮添加量＞接種量＞尿素添加量。

通過正交試驗進行了三菌混合發酵條件的優化，得到較優試驗條件為添加15%的麩皮和2%的尿素，先接種5%的枯草芽孢桿菌和10%的白地霉30℃培養24 h，然后接種5%的產朊假絲酵母30℃培養72 h。在此條件下蛋白轉化率高，其粗蛋白含量可達32.09%，真蛋白含量達24.85%，粗纖維含量降低到17.66%。

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Optimization of Mixed-Culture Fermentation Conditions for Biotransformation of Distilled Spirit Lees

JIAO Xiaofei, LIU Jianxue*, HAN Sihai, LI Xuan, LI Peiyan, LUO Denglin, ZHANG Weiwei, XU Baocheng
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

With the aim of achieving increased true protein content of distilled spirit lees, this studyinvestigated the effects of different mixed cultures and solid-state fermentation conditions on protein content of distilled spirit lees. Comparison was carried out with the unfermented control group. Fermentation experiments were conducted with pure and mixed cultures ofBacillus subtilis,Geotrichum candidumandCandida utilis, and the best results were obtained when all the three strains were used together. By the combined use of one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods, the optimal fermentation conditions were determined as follows∶ addition of wheat bran and urea to distilled spirit lees in proportions of 15%and 2%, respectively, and sequential culture at 30℃for 24 hwith 5%Bacillus subtilisand 10%Geotrichum candidumfollowed by 5%Candida utilisfor 72 h. The fermented lees under these conditions contained 24.85%true protein and 32.09%crude protein, and the crude fiber content was reduced to 17.66%.

distilled spirit lees; mixed-culture fermentation; true protein; optimization of fermentation conditions

Q939.99

1002-6630（2015）17-0164-05

10.7506/spkx1002-6630-201517031

2014-11-26

公益性行業（農業）科研專項（201413015）；河南省重點攻關項目（142102310262）

焦肖飛（1988—），女，碩士研究生，研究方向為農產品副產物高值化利用技術。E-mail：jiaoxiaofei0204@163.com

*通信作者：劉建學（1964—），男，教授，博士，研究方向為農產品高值化利用及質量檢測技術。E-mail：jx_liu@163.com